沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白基因的鑒定及表達(dá)譜分析

李 爽, 李 玲, 周曉榕, 龐保平,*, 單艷敏

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原昆蟲研究中心, 呼和浩特 010020; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站, 呼和浩特 010020)

Ca2+是一種多功能的第二信使，在生物體的發(fā)育過程和對各種環(huán)境刺激的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用(Berridgeetal., 2000)。鈣結(jié)合蛋白(calcium-binding protein, CaBP)作為Ca2+信號的受體，通過構(gòu)象改變和活性變化識別并傳遞特異的Ca2+信號至下游,引起下游特定的反應(yīng)變化(汪澈等, 2009)。最常見的鈣結(jié)合蛋白類型是具有1個或多個典型的螺旋-環(huán)-螺旋延長因子(EF-hand)基序(helix-loop-helix elongation factor hand motifs)的蛋白，由E螺旋和F螺旋組成，位于鈣離子結(jié)合環(huán)的側(cè)面，該結(jié)構(gòu)類似于手型(Ababou and Zaleska, 2015)。細(xì)胞中還有一些蛋白雖然沒有EF-hand結(jié)構(gòu)，但依然可以和Ca2+結(jié)合，包括與磷酸烯醇丙酮酸羧酶激酶相關(guān)的激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase-related kinase, PEPRK)、膜聯(lián)蛋白(annexin)、鈣聯(lián)蛋白(calnexin)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin, CRT)和磷酸酶D(phospholipase D)等。雖然已經(jīng)對鈣結(jié)合蛋白的功能開展了研究，但對許多細(xì)節(jié)和基因組信息仍然缺乏了解(Mohantaetal., 2019)。鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)是真核生物鈣結(jié)合蛋白EF-hand家族中了解最詳細(xì)的成員，其參與各種生理活動，包括新陳代謝、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、胞內(nèi)運動、神經(jīng)生長和肌肉收縮等(Haeseleeretal., 2002; Tidow and Nissen, 2013)。CaM在昆蟲發(fā)育變態(tài)(Jingetal., 2015)、嗅覺(Bahk and Jones, 2016; Mukundaetal., 2014, 2016)、味覺(Senoetal., 2005)、卵黃生成(Brownetal., 2010; Brubaker-Purkey and Woodruff, 2013; Wangetal., 2018)、抗藥性(Guoetal., 2019)以及昆蟲與寄主植物相互作用(Hattorietal., 2012; Yeetal., 2017)中可能起著重要作用。鈣磷蛋白(calcyphosine, CAPS)是一類在哺乳動物及后生動物中新發(fā)現(xiàn)的鈣結(jié)合蛋白，含有EF-hand基序，與CaM屬同一蛋白家族。雖然目前對其確切的功能還不清楚，但可能參與了cAMP和鈣-磷脂酰肌醇級聯(lián)之間的交叉信號傳遞, 而cAMP和鈣-磷脂酰肌醇級聯(lián)則是控制細(xì)胞生長和分化最為重要的途徑(鞠川等, 2006)。Lindner等(2019)從脂肪過多癥患者體內(nèi)鑒定出一種類鈣磷蛋白(calcyphosine-like, CAPSL)，其參與了脂肪的形成。肌鈣蛋白(troponin)是調(diào)節(jié)肌肉收縮的鈣感知(Ca2+-sensing)分子開關(guān)，是由肌鈣蛋白C(troponin C, TnC)、肌鈣蛋白T(troponin T, TnT)和肌鈣蛋白I(troponin I, TnI)3個亞基構(gòu)成的三聚復(fù)合體，其中TnC為具有EF-hand基序的鈣結(jié)合亞基，是細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變誘導(dǎo)肌肉收縮的關(guān)鍵功能組分(Umasuthanetal., 2013)。目前，大部分關(guān)于TnC的研究集中于脊椎動物，昆蟲TnC的研究很少。Fyrberg等(1994)分離了黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的3個TnC亞型;Chen等(2008)研究表明家蠶Bombyxmori的BmTnC在頭部、馬氏管、體壁和腸道等不同組織中差異表達(dá)。CRT是一類內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的多功能鈣結(jié)合蛋白，廣泛存在于包括哺乳動物、昆蟲、線蟲、原生動物及植物等各種生物中，屬于(K/H)DEL蛋白家族(Michalaketal., 1992, 1999)，在蛋白合成和折疊期間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制中起著重要作用(Ramosetal., 2011)。在昆蟲中，CRT可能參與嗅覺(Stoltzfusetal., 2003)、免疫反應(yīng)(Choietal., 2002; Asgari and Schmidt, 2003; Zhangetal., 2006; Wangetal., 2012)及早期發(fā)育(Ramosetal., 2011)。滯育是昆蟲應(yīng)對不良環(huán)境條件的生活策略，在昆蟲生長發(fā)育和存活過程中起著重要作用。然而，目前我們對Ca2+信號在昆蟲滯育中的調(diào)控作用很少了解。新近研究表明，在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Lu and Xu, 2010; Zhangetal., 2012)、二斑葉螨Tetranychusurticae(Zhaoetal., 2017)、家蠶(Hsieh and Gu, 2019)和淡色庫蚊Culexpipienspallens(Zhangetal., 2019)等滯育過程中許多鈣結(jié)合蛋白差異表達(dá)，意味著其在昆蟲滯育調(diào)控中可能起著重要作用。

沙蔥螢葉甲Galerucadaurica是一種近年來在內(nèi)蒙古草原上猖獗成災(zāi)的新害蟲，自2009年在內(nèi)蒙古錫林郭勒草原突然暴發(fā)成災(zāi)以來，發(fā)生范圍不斷擴(kuò)大，危害日趨嚴(yán)重，目前已擴(kuò)散到錫林郭勒盟、烏蘭察布市、呼倫貝爾市、巴彥淖爾市、鄂爾多斯市和阿拉善盟等6個盟市的20多個旗縣。該蟲發(fā)生于荒漠草原和退化草原，取食百合科蔥屬Allium沙蔥A.mongolium、多根蔥A.polyrhizum和野韭A.ramosum等植物，使本已脆弱的草原生態(tài)環(huán)境更加惡化(譚瑤等, 2017)。該蟲一年發(fā)生1代，春季越冬卵最早于4月上中旬開始孵化，夏季成蟲羽化約7～10 d后進(jìn)入專性滯育，羽化約80～90 d后解除滯育，開始取食、交尾和產(chǎn)卵，以卵滯育越冬(昊翔等, 2015; Zhouetal., 2016; 陳龍等, 2018b)。目前在昆蟲綱中以卵冬滯育同時以成蟲夏滯育的昆蟲未見有過報道，沙蔥螢葉甲為研究滯育提供了很好的研究材料。然而，目前對其滯育機(jī)理了解得還很少。本實驗室前期研究了成蟲不同夏滯育階段體內(nèi)糖類、蛋白、脂肪含量(陳龍等, 2018b)及海藻糖酶(陳龍等, 2018a)和熱激蛋白(陳龍等, 2019)基因表達(dá)量的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，多個鈣結(jié)合蛋白在沙蔥螢葉甲成蟲夏滯育不同階段差異表達(dá)(Maetal., 2019)。本研究根據(jù)本實驗組裝的沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，應(yīng)用生物信息學(xué)和RT-PCR方法克隆獲得沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白基因序列，對其序列特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用qPCR技術(shù)檢測其在成蟲滯育過程中及不同溫度下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步明確鈣結(jié)合蛋白在沙蔥螢葉甲滯育調(diào)控中的作用奠定必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

2019年5月于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗采集沙蔥螢葉甲幼蟲，置于室內(nèi)自然變溫條件下以野韭為食飼養(yǎng)，待羽化為成蟲后作為供試蟲源。取3日齡成蟲雌雄各2頭混樣作為基因克隆的cDNA模板。qPCR實驗包括兩類樣品：(1)不同溫度處理樣品：選取羽化后3日齡成蟲，分別放置在0, 5, 10, 15, 20, 25, 30及35℃的低溫培養(yǎng)箱(LRH-100CB型，上海一恒儀器公司)中處理1 h；(2)不同日齡成蟲樣品：選取羽化3, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90和110 d的成蟲作為供試蟲源，其中羽化后3 d的成蟲處于滯育前，羽化后7 d開始進(jìn)入滯育期(7-20 d為滯育初期、30-40 d為滯育中期、60 d為滯育后期)，羽化后90 d滯育終止。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)雌雄各2頭。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

以1.1節(jié)收集的蟲源為模板，按照RNAiso Plus(TaKaRa，大連)操作說明提取總RNA。提取的總RNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(Nano PhotometerTM-Class，德國)檢測總RNA質(zhì)量、濃度和純度。分別取1 μg總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)操作說明合成cDNA第1鏈，放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 鈣結(jié)合蛋白基因的克隆

根據(jù)本實驗室組裝的沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，篩選關(guān)于鈣結(jié)合蛋白的全部序列，選取4個具有完整開放閱讀框(ORF)的鈣結(jié)合蛋白基因序列，利用Primer Primer 5.0設(shè)計引物(表1)。擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL): cDNA模板1 μL, PCR Master Mix 12.5 μL, 上下游引物(0.2 μmol/L)各1 μL, RNase-free Water 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件: 94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸 30 s, 30個循環(huán); 72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖電泳檢測后，膠回收目的片段。將回收的目的片段與pMD?19-T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選, 挑選白色菌落進(jìn)行PCR驗證，將驗證過的菌液繼續(xù)過夜培養(yǎng)過夜后，送至上海生工公司進(jìn)行測序。

表1 引物信息

1.4 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中ORF Finder對沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白基因的開放性閱讀框進(jìn)行預(yù)測(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)；利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行分子量及理論等電點的預(yù)測；利用SingalP 5.0軟件進(jìn)行信號肽預(yù)測(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；利用TMHMM Server 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜區(qū)的預(yù)測；利用Scan Prosite(https:∥prosite.expasy.org/)對蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測。利用MEGA 6.0軟件的鄰接法(重復(fù)運行1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 鈣結(jié)合蛋白基因表達(dá)譜qPCR分析

qPCR反應(yīng)體系(20 μL): 模板cDNA 2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, GoTaq?qPCR Master Mix(2×)10 μL(Promega，美國), Nuclease-Free Water 7.2 μL。選用沙蔥螢葉甲SDHA(GenBank登錄號: KU240575)作為內(nèi)參基因(Tanetal., 2017)，每個處理3次生物學(xué)重復(fù)及3次技術(shù)重復(fù)。使用qPCR儀(FTC-3000，F(xiàn)unglyn Biotech，加拿大)進(jìn)行測定。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s, 60℃退火1 min, 40個循環(huán); 95℃變性15 s, 60℃退火15 s, 95℃延伸15 s。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)測定沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白的相對表達(dá)量，不同日齡成蟲及不同溫度下鈣結(jié)合蛋白的相對表達(dá)量差異顯著性分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏新復(fù)極差法。運用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白基因的鑒定及序列特征

通過對沙蔥螢葉甲成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的BlastX比對分析，經(jīng)RT-PCR克隆、測序驗證及生物信息學(xué)分析獲得4個具有完整開放閱讀框(ORF)的鈣結(jié)合蛋白基因序列，依次命名為GdCaM,GdCAPSL,GdTnCl和GdCRT(GenBank登錄號：MN695412-MN695415)。ORF全長分別為450, 648, 516和1 209 bp，分別編碼149, 215, 171和402個氨基酸殘基，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量分別為16.81, 24.34, 19.67和46.43 kD，等電點pI分別為3.84, 4.57, 3.95和4.17。GdCaM, GdCAPSL和GdTnCl無信號肽，分別與玉米根螢葉甲DiabroticavirgiferavirgiferaCaM, CAPSL和TnCl的氨基酸序列一致性最高，分別為100%，74.0%和88.2%；GdCRT與馬鈴薯甲蟲LeptinotarsadecemlineataCRT的氨基酸序列一致性最高(92.5%)。根據(jù)EF-hand基序的共有序列D-x-DNE-x-DNS-GP-x-ILVFM-DSE-x-x-DE(x代表任意氨基酸)，運用Scan Prosite在線軟件分析顯示(圖1)：GdCaM有4個典型的結(jié)構(gòu)和功能性EF-hand基序；GdCAPSL有3個EF-hand基序，其中EF-hand 4基序缺失[EF-hand基序氨基酸被替代，其中第1位的甘氨酸(Gly)替代了天冬氨酸(Asp)，第3位的蘇氨酸(Thr)替代了天冬氨酸/天冬酰胺(Asn)/谷氨酸(Glu)]；GdTnCl只有2個EF-hand基序，其中EF-hand 1和EF-hand 3基序均缺失[EF-hand 1基序第5位的賴氨酸(Lys)替代了天冬氨酸/天冬酰胺(Asn)/絲氨酸(Ser)，第6位的谷氨酰胺(Glu)替代了甘氨酸(Gly)/脯氨酸(Pro)，第12位的蛋氨酸(Met)替代了谷氨酸(Glu)/天冬氨酸(Asp)；EF-hand 3基序第5位的亮氨酸(Leu)替代了天冬氨酸/天冬酰胺(Asn)/絲氨酸(Ser)，第12位的亮氨酸替代了谷氨酸(Glu)/天冬氨酸(Asp)]。GdCRT不具有EF-hand基序，但GdCRT具有2條典型的鈣網(wǎng)蛋白(CRT)家族標(biāo)簽序列(K97HEQNIDCGGGYV KVF112和L129MFGPDiCG137)、三重復(fù)序列(I207kDPEAKKPEDWD219, I224PDPDDTKPEDWD236和I241PDPDATKPDDWD253)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列HDEL(圖2)。

圖1 沙蔥螢葉甲EF-hand鈣結(jié)合蛋白序列分析

2.2 沙蔥螢葉甲及其他鞘翅目昆蟲鈣結(jié)合蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

將沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的其他鞘翅目鈣結(jié)合蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)樹，結(jié)果圖3表明：具有EF-hand基序的GdCaM, GdCAPSL和GdTnCl分別與其他鞘翅目昆蟲的CaM, CAPSL和TnCl各構(gòu)成一個分支，其中GdCaM置信度均為100%，在進(jìn)化過程中具有高度保守的進(jìn)化特征；不同昆蟲TnCl間保守性較高，置信度介于47%～99%之間，其中GdTnCl與玉米根螢葉甲的TnCl親緣關(guān)系最近，最先聚在一起。這3類具有EF-hand基序的鈣結(jié)合蛋白親緣關(guān)系較近，共同聚為一個大分支，最后與CRT聚在一起。GdCRT與其他鞘翅目昆蟲的CRT單獨聚為一個分支，但不同昆蟲CRT間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，置信度較低。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的沙蔥螢葉甲及其他鞘翅目昆蟲鈣結(jié)合蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))

2.3 沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白基因在不同日齡成蟲中的表達(dá)分析

qPCR結(jié)果(圖4)表明，GdCaM,GdCAPSL,GdTnCl和GdCRT在不同日齡成蟲中的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)，且表達(dá)模式不同。GdCaM在成蟲滯育前(羽化后3 d)表達(dá)量最高，開始進(jìn)入夏滯育后(羽化后7 d)表達(dá)量降低，在滯育期間(羽化后7-60 d)變化較小，而解除滯育后(羽化后90 d)表達(dá)量又顯著下調(diào)(圖4: A)。GdCAPSL在成蟲羽化后表達(dá)量逐漸下降, 在滯育初期(羽化后10 d)維持在最低水平，進(jìn)入滯育中后期(羽化后40 d和60 d)開始回升，滯育解除后又突然下調(diào)至最低水平，而羽化后110 d急劇上升至最高水平(圖4: B)。GdTnCl隨成蟲發(fā)育上調(diào)表達(dá)，在滯育初期(羽化后15-20 d)達(dá)最高水平，進(jìn)入滯育中后期(羽化后30-60 d)急劇下降至最低水平，滯育解除后再次上調(diào)，但在羽化后110 d突然下調(diào)至最低水平(圖4: C)。GdCRT在進(jìn)入滯育后表達(dá)量開始逐漸下調(diào)，在滯育維持期(羽化后15-60 d)維持在低水平，滯育解除后又開始上升(圖4: D)。

圖4 沙蔥螢葉甲不同日齡成蟲體內(nèi)鈣結(jié)合蛋白基因的相對表達(dá)量

2.4 沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白在不同溫度脅迫下的表達(dá)分析

從圖5可知，溫度對除GdCRT外的其他3種鈣結(jié)合蛋白基因(GdCaM,GdCAPSL和GdTnCl)表達(dá)量均有顯著影響(P<0.05)。當(dāng)溫度高于20℃，隨著溫度的逐漸上升，GdCaM的表達(dá)量逐漸上升；當(dāng)溫度低于20℃時，隨著溫度的逐漸降低，GdCaM的表達(dá)量上調(diào)，在5℃達(dá)到最高值，但0℃時又突然下降到最低值(圖5: A)。GdCAPSL的表達(dá)量隨著溫度的升高而呈現(xiàn)上升的趨勢，25℃時達(dá)到最高，然后下降(圖5: B)。GdTnCl在0℃時表達(dá)量最高，隨著溫度的升高，表達(dá)量呈現(xiàn)整體降低的趨勢(圖5: C)。

3 討論

根據(jù)沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，本研究首次鑒定和克隆得到4條具有完成ORF的鈣結(jié)合蛋白基因cDNA序列，其中3條編碼的蛋白屬于具有典型EF-hand結(jié)構(gòu)域的鈣結(jié)合蛋白家族，另一條編碼的蛋白為不含EF-hand結(jié)構(gòu)域但具有鈣結(jié)合能力的鈣網(wǎng)蛋白(CRT)。氨基酸序列比對分析表明，沙蔥螢葉甲GdCaM序列與其他鞘翅目昆蟲CaM的完全相同，均具有4個典型的EF-hand基序，進(jìn)一步說明CaM具有高度保守的進(jìn)化特征(李慶偉等, 2017)。我們從沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫BLAST獲得一條類似鈣磷蛋白(calcyphosine-like, CAPSL)的序列，其與同屬螢葉甲亞科的玉米根螢葉甲CAPSL一致性最高(74%)，命名為GdCAPSL。結(jié)構(gòu)域分析表明，GdCAPSL具有3個典型的EF-hand基序，而CAPS與CaM一樣具有4個EF-hand基序(鞠川等, 2006)。TnC也是具有4個典型的EF-hand基序的鈣結(jié)合蛋白，但由于一些TnC中某些基序上的鈣離子結(jié)合所必需的氨基酸殘基發(fā)生突變，使得其失去2個甚至更多的鈣離子結(jié)合位點(Qiuetal., 2003)。本研究獲得的沙蔥螢葉甲TnC失去2個鈣離子結(jié)合位點，只剩2個EF-hand基序，且與玉米根螢葉甲TnCl的氨基酸序列一致性最高(88.2%)，因而命名為GdTnCl。CRT是不具有EF-hand結(jié)構(gòu)域的鈣結(jié)合蛋白，但至少具有3個典型的功能結(jié)構(gòu)域：(1)N端結(jié)構(gòu)域：具有一段信號肽、2條保守的鈣網(wǎng)蛋白家族標(biāo)簽序列KHEQNIDCGGGY和IMFGPDICG；(2)P端結(jié)構(gòu)域：富含脯氨酸，并有1個高親和性、低容量的鈣離子結(jié)合位點和2組三重復(fù)序列；(3)C端結(jié)構(gòu)域：擁有一個高容量、低親和性的鈣離子結(jié)合位點和典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽(K/H)DEL(Michalaketal., 1992, 1999)。生物信息學(xué)分析表明，本研究克隆獲得的一段ORF編碼的蛋白序列具有上述特征，而且與馬鈴薯甲蟲CRT氨基酸序列一致性高達(dá)92.5%，因此將該序列命名為GdCRT。

CaM是一種重要的調(diào)節(jié)蛋白，能結(jié)合第二信使Ca2+和多種靶蛋白，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程和發(fā)育。GdCaM在沙蔥螢葉甲成蟲滯育前(羽化后3 d)的表達(dá)量最高，隨后在進(jìn)入滯育后(羽化后7 d)表達(dá)量顯著下降(圖4: A)，這一規(guī)律與棉鈴蟲幼蟲滯育過程CaM水平降低(Lu and Xu, 2010; Zhangetal., 2012)相一致；淡色庫蚊滯育的各階段中CaM表達(dá)也呈現(xiàn)顯著變化，表明CaM可能在滯育過程中起重要的調(diào)控作用(Zhangetal., 2019)。但在解除滯育后，GdCaM表達(dá)量進(jìn)一步下降的原因尚不清楚。Teets等(2013)發(fā)現(xiàn)鈣信號介導(dǎo)昆蟲冷感應(yīng)，當(dāng)25℃下降到0℃，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加40%，并使得鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)活性升高。與本研究中發(fā)現(xiàn)短時高溫和低溫脅迫均導(dǎo)致GdCaM表達(dá)量上調(diào)，而0℃時GdCaM的表達(dá)量低于5℃時的(圖5: A)，可能是過低的溫度使得GdCaM表達(dá)受到抑制。

CAPSL也屬于鈣結(jié)合蛋白EF-hand家族，可能與CaM存在相互作用(Klimmecketal., 2008)。CAPSL在沙蔥螢葉甲成蟲滯育中后期(羽化后40-60 d)表達(dá)量顯著上調(diào)(圖4: B)。Zhao等(2017)也發(fā)現(xiàn)，與非滯育對照相比，CAPSL在二斑葉螨滯育第3和第13天表達(dá)量顯著上調(diào)。說明GdCAPSL可能與沙蔥螢葉甲滯育調(diào)控有關(guān)。

TnC通過結(jié)合鈣離子發(fā)揮其生物學(xué)功能，TnC隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，引起肌動蛋白與肌球蛋白發(fā)生相互作用，產(chǎn)生肌肉收縮或擴(kuò)張(Filatovetal., 1999)，肌肉結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性在寒冷生存過程中起著至關(guān)重要的作用(Zhaoetal., 2017)。本研究中發(fā)現(xiàn)，GdTnCl的表達(dá)量隨著溫度的降低而上升(圖5: C)，表明GdTnCl可能通過參與調(diào)節(jié)肌肉結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而提升昆蟲在寒冷條件下的適應(yīng)能力。GdTnCl在沙蔥螢葉甲成蟲滯育初期(羽化后7-20 d)表達(dá)量上調(diào)，在滯育中后期(羽化后30-60 d)下調(diào)表達(dá)(圖4: C)。尖音庫蚊Culexpipiens中發(fā)現(xiàn)肌動蛋白(actin)在滯育初期表達(dá)量上調(diào)，滯育后期又回到低水平(Kimetal., 2006)。GdTnCl可能通過對肌動蛋白的作用間接調(diào)控細(xì)胞骨架系統(tǒng)，引起細(xì)胞骨架系統(tǒng)重排，通過結(jié)構(gòu)組分改變對沙蔥螢葉甲夏滯育做出反應(yīng)。

GdCRT在沙蔥螢葉甲成蟲滯育期間(羽化后7-60 d)的表達(dá)量顯著低于滯育前(羽化后3 d)和解除滯育后(羽化后90 d)(圖4: D)，CRT可能通過表達(dá)量的下調(diào)來調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)昆蟲進(jìn)入滯育。在棉鈴蟲滯育期幼蟲滯育誘導(dǎo)過程中，同樣發(fā)現(xiàn)CRT表達(dá)量水平下降(Lu and Xu, 2010)。另外，沙蔥螢葉甲成蟲羽化110 d時GdCAPSL和GdCRT的表達(dá)量達(dá)到最高值，而GdTnCl的表達(dá)量降為最低值，此時雌雄成蟲已經(jīng)進(jìn)行交尾受孕，我們推測對應(yīng)的3種CaBP可能在生殖過程中也發(fā)揮著潛在作用。

本研究首次成功克隆了4個沙蔥螢葉甲鈣結(jié)合蛋白基因，并進(jìn)行了分子特性及在成蟲發(fā)育過程中和不同溫度下的表達(dá)分析，為進(jìn)一步明確鈣結(jié)合蛋白在沙蔥螢葉甲發(fā)育和成蟲滯育中的作用奠定了基礎(chǔ)。