桔小實(shí)蠅肽聚糖識(shí)別蛋白基因BdPGRP-SB1的克隆及功能鑒定

張迎新, 陳 冬, 張?zhí)K蕓, 魏 冬,*, 王進(jìn)軍

(1.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 昆蟲學(xué)及害蟲控制工程重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715; 2.西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715)

先天免疫是昆蟲抵御微生物感染的重要防線，該免疫過程主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫，兩者共同作用對(duì)昆蟲起到有效的保護(hù)(Lemaitre and Hoffmann, 2007; 陳康康和呂志強(qiáng), 2014)。細(xì)胞免疫通過血細(xì)胞介導(dǎo)完成，包括吞噬作用、集結(jié)作用和包囊作用(Lavine and Strand, 2002)；體液免疫通過抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)和黑化反應(yīng)來抵御病原體(Kimbrell and Beutler, 2001; Hultmark, 2003)。肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)在昆蟲抵御微生物的先天免疫中具有重要作用(Liuetal., 2001; Luetal., 2020)。PGRP可識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖(peptidoglycan, PGN)，進(jìn)而激活Toll途徑和Imd途徑，觸發(fā)抗菌肽產(chǎn)生(Hultmark, 2003; Beutler, 2004; Wangetal., 2019)。其中Toll途徑由革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌激活，而Imd途徑由革蘭氏陰性細(xì)菌激活(Lemaitre, 2004; Lemaitre and Hoffmann, 2007; Hetru and Hoffmann, 2009)。所有革蘭氏陰性菌和一部分革蘭氏陽性菌(如芽孢桿菌)的PGN在肽鏈第3個(gè)位點(diǎn)具有一個(gè)內(nèi)消旋-二氨基庚二酸殘基，而其他的革蘭氏陽性菌在該處具有一個(gè)L-賴氨酸(Lys)殘基(Schleifer and Kandler, 1972; 陳康康和呂志強(qiáng), 2014)。

Yoshida等(1996)在家蠶Bombyxmori血淋巴中首次純化出PGRP蛋白，分子量約為19 kD，可與肽聚糖結(jié)合并激活酚氧化酶途徑。隨后在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、煙草天蛾Manducasexta和岡比亞按蚊Anophelesgambiae等昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了許多PGRP基因(Kangetal., 1998; Werneretal., 2000; Christophidesetal., 2002; Yuetal., 2002)。從脊椎動(dòng)物到無脊椎動(dòng)物，PGRP分布廣泛且進(jìn)化保守，根據(jù)其長(zhǎng)度可分為長(zhǎng)型PGRP(PGRP-L)和短型PGRP(PGRP-S)(Werneretal., 2000; Christophidesetal., 2002)。目前在果蠅中鑒定到13個(gè)PGRP基因，其中有7個(gè)短型PGRP基因，包括PGRPS-SA,PGRP-SB1,PGRP-SB2,PGRP-SC1a,PGRP-SC1b,PGRP-SC2和PGRP-SD(Werneretal., 2000; Kurata, 2014)。短型PGRP是具有信號(hào)肽的細(xì)胞外蛋白，廣泛分布于血淋巴、表皮和脂肪體中，也有少量在腸道表皮細(xì)胞和血細(xì)胞中分布(Myllymakietal., 2014)。

在果蠅中，許多PGRP都充當(dāng)了Toll通路和Imd途徑的激活劑和調(diào)節(jié)劑(Dziarski, 2004; Wangetal., 2019)。果蠅PGRP-SA和PGRP-SD是在血淋巴中循環(huán)的分泌蛋白，其響應(yīng)革蘭氏陽性細(xì)菌的Lys型PGN，從而激活Toll途徑(Micheletal., 2001; Bischoffetal., 2004)。PGRP-LF對(duì)NF-kB/Imd通路的負(fù)調(diào)控誘導(dǎo)果蠅細(xì)胞正常凋亡，以確保果蠅正常發(fā)育(Tavignotetal., 2017; Luetal., 2020)。PGRP-LB, PGRP-SC1a/b和PGRP-SC2對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌敏感，是Imd通路的負(fù)調(diào)控因子，可防止宿主過度激活免疫反應(yīng)，對(duì)昆蟲起到保護(hù)作用(Paredesetal., 2011)。PGRP-SC1a/b和PGRP-SC2負(fù)責(zé)去除糖鏈上的多肽，與PGRP-LB和Pirk一起負(fù)調(diào)控Imd通路(Paredesetal., 2011)，Toll通路的完全激活也需要PGRP-SC1和PGRP-SC2的參與(Costechareyreetal., 2016)。果蠅PGRP-SB1被證明在脂肪體內(nèi)通過Imd途徑活化后大量分泌到血淋巴中，且具有酰胺酶活性，但并未有相應(yīng)的表型(Mellrothetal., 2003; Zaidman-Rémyetal., 2006, 2011)。

桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis屬于雙翅目(Diptera)實(shí)蠅科(Tephritidae)果實(shí)蠅屬Bactrocera，為重要的世界性檢疫害蟲(Clarkeetal., 2005; Liuetal., 2019)。在桔小實(shí)蠅中，對(duì)PGRPs的研究還相對(duì)較少。最近有研究表明，桔小實(shí)蠅BdPGRP-SA和BdPGRP-SD參與識(shí)別革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，從而激活下游attacin-A,defensin和diptericin等AMP基因的表達(dá)以應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染(Weietal., 2019)。為進(jìn)一步分析桔小實(shí)蠅中其他的PGRP，豐富對(duì)桔小實(shí)蠅中PGRP功能的認(rèn)識(shí)，本研究克隆了桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1的cDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行不同發(fā)育階段和成蟲不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析，利用RNAi抑制其表達(dá)水平進(jìn)一步研究其功能，以探究BdPGRP-SB1在桔小實(shí)蠅免疫中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

研究所用桔小實(shí)蠅2008年采自中國(guó)海南省?？谑杏谑覂?nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度27±0.5℃、相對(duì)濕度75%±5%、光周期14L∶10D，采用人工飼料飼養(yǎng)(Wangetal., 2013)。

1.2 RNA提取及cDNA的合成

收集不同發(fā)育階段的試蟲，包括：卵(n=100)，第1(n=100)、3(n=100)、5(n=10)和8日齡(n=4)幼蟲，第1, 3, 5和7日齡蛹(n= 4)，以及第1, 3, 5和7日齡成蟲(n=2)。解剖5日齡成蟲中腸、馬氏管、后腸、脂肪體、卵巢和精巢等組織(n=20)，使用TRIzol(Invitrogen，美國(guó))提取桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段及成蟲不同組織的總RNA。每組樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用NanoDrop One核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo，美國(guó))測(cè)定RNA濃度及質(zhì)量，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。使用RQ1 RNase-Free DNase試劑盒(Promega，美國(guó))去除基因組DNA，以500 ng總RNA為模板按照PrimeScript RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連)說明書合成cDNA第1鏈。

1.3 BdPGRP-SB1基因克隆

分別使用Premier 6.0軟件(PREMIER Biosoft，美國(guó))和DNAMAN 5.0(Lynnon Biosoft，美國(guó))設(shè)計(jì)和評(píng)估全長(zhǎng)PCR引物(表1)。使用桔小實(shí)蠅5日齡成蟲cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)體系(25 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各1 μL, Primer STAR Max Premix(2×)(TaKaRa，大連)5 μL, ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 34個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min(Weietal., 2018)。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，根據(jù)Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0膠回收試劑盒(TaKaRa，大連)說明書純化回收目的條帶；將純化的片段連接到pGEM-T Easy載體(Promega，美國(guó))中；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；用通用M13引物篩選陽性克隆送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)獲得PGRP基因序列；利用ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam)預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)；利用InterPScan 5(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5)分析PGRP蛋白序列的功能結(jié)構(gòu)域；分別使用在線軟件SignalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0)和TMHMM Server 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)分析信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域；NCBI上查找其他昆蟲的PGRP序列，使用CLUSTALX 2.0進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并使用Jalview軟件2.9(Waterhouseetal., 2009)進(jìn)行多序列編輯；MEGA 5軟件的鄰接(neighbor-joining, NJ)法構(gòu)建桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1和其他物種PGRPs的系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置1 000次bootstraps進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.5 BdPGRP-SB1時(shí)空表達(dá)模式檢測(cè)

使用Primer Premier 3(http:∥fokker.wi.mit.edu/primer3)設(shè)計(jì)定量引物(表1)。檢測(cè)肽聚糖識(shí)別蛋白基因BdPGRP-SB1的表達(dá)量，使用Novostar-SYBR SuperMix試劑盒(Novoprotein，上海)和CFX384TMReal-Time PCR Detection System實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(Bio-Rad，美國(guó))分析其在不同發(fā)育階段和不同成蟲組織中的表達(dá)模式。RT-qPCR體系(10 μL): cDNA模板0.5 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL, qPCR SuperMix 5 μL, 無核酶水3.5 μL。qPCR反應(yīng)條件: 95℃ 2 min; 95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán); 60℃ 1 min; 95℃ 10 min(Weietal., 2018)。以桔小實(shí)蠅α-Tubulin(GenBank登錄號(hào): GU269902)為內(nèi)參基因(Shenetal., 2010)。

1.6 細(xì)菌肽聚糖誘導(dǎo)BdPGRP-SB1基因表達(dá)

將大腸桿菌E.coli0111:B4肽聚糖(PGN-EB)和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus肽聚糖(PGN-SA)(InvivoGen，美國(guó))用無菌水稀釋至100 μg/mL分別注射桔小實(shí)蠅5日齡雌成蟲，每頭蟲200 nL，等體積無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含3頭雌蟲。在注射后3, 6, 9, 12和24 h后取樣提取總RNA，利用RT-qPCR技術(shù)(反應(yīng)體系及條件同1.5節(jié))，將對(duì)照組中基因表達(dá)量作為1，用于分析BdPGRP-SB1在肽聚糖誘導(dǎo)后的表達(dá)變化。

1.7 RNAi實(shí)驗(yàn)

使用特異性引物(表1)通過PCR擴(kuò)增目的基因片段，使用Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit試劑盒(Thermo，美國(guó))，按說明書以擴(kuò)增出來的目的片段為模版合成雙鏈RNA(dsRNA)。使用NanoDrop One核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo，美國(guó))測(cè)量dsRNA濃度，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dsRNA的完整性。將dsRNA稀釋至4 000 ng/μL左右，使用Nanoject II Auto-Nanoliter Injector(WPI，美國(guó))將dsRNA注射入桔小實(shí)蠅雌成蟲腹部末端，每頭蟲注射2 000 ng，等量dsGFP作為對(duì)照。分別在注射dsRNA之后24和48 h后收樣提取總RNA用于檢測(cè)目的基因沉默效率，反應(yīng)體系及條件同1.5節(jié)，每個(gè)處理收集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含3頭雌蟲。

表1 本研究所用引物

在注射dsRNA 24 h后，分別注射200 nL OD600為1.8的革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌DH5α和200 nL OD600為0.3的革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌，每個(gè)處理包括至少30頭試蟲，統(tǒng)計(jì)注射后5 d內(nèi)的存活率。

RNAi處理試蟲后24 h注射200 nL OD600為1.8的滅活大腸桿菌，以注射dsGFP和PBS為對(duì)照，24 h后收集樣品并且提取總RNA，去基因組后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用RT-qPCR檢測(cè)抗菌肽基因表達(dá)量，反應(yīng)體系及條件同1.5節(jié)。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物重復(fù)3頭雌蟲。參考桔小實(shí)蠅PGRP-SA和PGRP-SD的研究，選取3個(gè)抗菌肽基因attacin-A(GenBank登錄號(hào): KY038167)，defensin(GenBank登錄號(hào): KX510002)和diptericin(GenBank登錄號(hào): KJ488999)分析其表達(dá)量變化(Weietal., 2019)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

基因相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt法計(jì)算(Livak and Schmittgen, 2001)，基因時(shí)空表達(dá)模式分析中基因相對(duì)表達(dá)量使用單因素方差分析及最小顯著差法(LSD)分析差異顯著性；RNAi和細(xì)菌誘導(dǎo)中死亡率和基因表達(dá)量差異顯著性采用Student氏獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 BdPGRP-SB1的克隆和序列分析

擴(kuò)增獲得桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1(GenBank登錄號(hào): MN892482)，開放閱讀框長(zhǎng)558 bp，編碼185個(gè)氨基酸。其編碼蛋白BdPGRP-SB1預(yù)測(cè)分子量為21.45 kD，等電點(diǎn)為8.57，無跨膜結(jié)構(gòu)域，具有PGRP保守結(jié)構(gòu)域(第42-181位氨基酸)，前端含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，為分泌型蛋白。這些特征表明，BdPGRP-SB1屬于短型PGRP。

選取果蠅、地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata、埃及伊蚊Aedesaegypti、家蠅Muscadomestica和家蠶Bombyxmori的同源氨基酸序列與BdPGRP-SB1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(圖1)，昆蟲PGRPs保守區(qū)域十分一致，結(jié)構(gòu)域高度保守。BdPGRP-SB1含有3個(gè)保守的半胱氨酸殘基和6個(gè)PGRP/酰胺酶活性所需的氨基酸殘基，表明BdPGRP-SB1具有Zn2+依賴性酰胺酶活性。Arg99殘基為DAP型PGN識(shí)別位點(diǎn)，表明BdPGRP-SB1可識(shí)別DAP型PGN。

圖1 桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1和其他昆蟲PGRP序列比對(duì)

使用MEGA 5軟件的鄰接法聯(lián)合桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1和其他物種PGRPs構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1與辣椒實(shí)蠅Bactroceralatifrons的PGRP-SB1親緣關(guān)系最近，氨基酸序列一致性達(dá)96%(圖2)。

圖2 基于氨基酸序列的桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1 和其他昆蟲PGRPs系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 BdPGRP-SB1時(shí)空表達(dá)模式

以α-Tubulin作為內(nèi)參基因，對(duì)桔小實(shí)蠅不同發(fā)育時(shí)期以及成蟲不同組織中BdPGRP-SB1表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:BdPGRP-SB1在桔小實(shí)蠅各階段均有所表達(dá)，在3日齡幼蟲、1日齡蛹和成蟲期高表達(dá)，顯著高于在卵和其他日齡的幼蟲及蛹中表達(dá)量(圖3: A)，其中3日齡幼蟲中表達(dá)量是卵期的409倍(P<0.05)，1日齡蛹中表達(dá)量是卵期的257倍(P<0.05)，5日齡成蟲中的表達(dá)量是卵期的543倍(P<0.001)。BdPGRP-SB1在成蟲各組織中亦均有所表達(dá)，在脂肪體中表達(dá)量最高，其次是在中腸、后腸和精巢中，在馬氏管和卵巢中表達(dá)水平較低(圖3: B);BdPGRP-SB1在脂肪體中的表達(dá)量是在卵巢中表達(dá)量的30倍(P<0.001)，在中腸中的表達(dá)量是在卵巢中表達(dá)量的20倍(P<0.001)。

圖3 BdPGRP-SB1在桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段(A)和成蟲不同組織(B)中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 肽聚糖對(duì)BdPGRP-SB1轉(zhuǎn)錄水平的影響

注射大腸桿菌肽聚糖(PGN-EB)和金黃色葡萄球菌肽聚糖(PGN-SA)均能誘導(dǎo)桔小實(shí)蠅雌成蟲體內(nèi)BdPGRP-SB1表達(dá)水平變化(圖4)。BdPGRP-SB1表達(dá)量在PGN-EB誘導(dǎo)后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)，在誘導(dǎo)3 h時(shí)最高，較對(duì)照上調(diào)31倍(P<0.05)，隨后逐漸下降，在誘導(dǎo)6 h時(shí)較對(duì)照上調(diào)11倍(P<0.05)，在誘導(dǎo)9 h時(shí)較對(duì)照上調(diào)10倍(P<0.05)，在誘導(dǎo)24 h時(shí)較對(duì)照僅上調(diào)3倍(P<0.01)(圖4: A)。BdPGRP-SB1在PGN-SA誘導(dǎo)后的多個(gè)時(shí)間段也顯著上調(diào)，在誘導(dǎo)3 h時(shí)較對(duì)照上調(diào)9倍(P<0.05)，在誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)量最高，較對(duì)照上調(diào)11倍(P<0.05)，隨后逐漸下降，在誘導(dǎo)9 h時(shí)較對(duì)照上調(diào)5倍(P<0.01)，在誘導(dǎo)24 h時(shí)較對(duì)照上調(diào)3倍(P<0.05)(圖4: B)。結(jié)果說明BdPGRP-SB1對(duì)PGN-EB更為敏感。

圖4 分別注射PGN-EB(A)和PGN-SA(B)后桔小實(shí)蠅5日齡雌成蟲中BdPGRP-SB1的表達(dá)量

2.4 BdPGRP-SB1基因功能分析

桔小實(shí)蠅5日齡雌成蟲注射dsBdPGRP-SB1 24 h和48 h后BdPGRP-SB1均能被有效沉默，沉默效率分別為55%(P<0.01)和76%(P<0.01)(圖5: A)。利用RNAi干擾桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1表達(dá)后，再分別注射大腸桿菌和金黃色葡萄球菌后桔小實(shí)蠅雌成蟲在5 d內(nèi)的存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在大腸桿菌注射組中dsBdPGRP-SB1處理組(30%)較對(duì)照組(54%)存活率顯著性降低(P<0.01)(圖5: B)，在金黃色葡萄球菌注射組中dsBdPGRP-SB1處理組存活率(13%)與對(duì)照組(14%)無顯著差異(圖5: C)。說明BdPGRP-SB1參與桔小實(shí)蠅免疫系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌的識(shí)別。

圖5 RNAi后BdPGRP-SB1的沉默效率(A)以及大腸桿菌(B)和金黃色葡萄球菌(C)侵染桔小實(shí)蠅雌成蟲的存活率

干擾BdPGRP-SB1后24 h注射滅活的大腸桿菌，桔小實(shí)蠅雌成蟲中attacin-A,defensin和diptericin3種抗菌肽基因的表達(dá)量與注射dsGFP和滅活E.coli的對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)(圖6)，其中attacin-A上調(diào)1.73倍(P<0.05)，defensin上調(diào)3.16倍(P<0.01)，diptericin上調(diào)1.68倍(P<0.05)。表明BdPGRP-SB1參與識(shí)別大腸桿菌，抑制其表達(dá)后抗菌肽被激活。

圖6 RNAi干擾BdPGRP-SB1表達(dá)后注射滅活大腸桿菌桔小實(shí)蠅雌成蟲中抗菌肽基因attacin-A(A),defensin(B)和diptercin(C)的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

昆蟲依靠先天免疫防御微生物病原體，先天免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫，體液免疫可誘導(dǎo)的AMPs和血淋巴中活化的酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Royetetal., 2005)。肽聚糖識(shí)別蛋白在昆蟲識(shí)別細(xì)菌感染中起關(guān)鍵作用(Lemaitre and Hoffmann, 2007; Wangetal., 2019)。本研究克隆獲得到了桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1全長(zhǎng)。序列分析(圖1)發(fā)現(xiàn)BdPGRP-SB1具有Arg殘基，可識(shí)別DAP型PGN，同時(shí)具有5個(gè)保守殘基，具有T7溶菌酶Zn2+依賴性酰胺酶活性，表明該基因可能參與具有DAP型PGN的革蘭氏陰性細(xì)菌的識(shí)別。在果蠅中，同系物PGRP-SB1具有N端乙酰胞壁酸(N-acetylmuramoyl)和L端丙氨酸酰胺酶(L-alanine amidase)，具有T7溶菌酶Zn2+依賴性酰胺酶活性，對(duì)DAP型PGN具有較高活性，對(duì)大多數(shù)Lys型PGN活性較低(Mellroth and Steiner, 2006)。BdPGRP-SB1與其他昆蟲的PGRP系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，其與辣椒實(shí)蠅PGRP親緣關(guān)系較高(圖2)，暗示著其功能上的保守性。

短型PGRPs廣泛存在于昆蟲血淋巴、表皮和脂肪體等組織中，它們主要在脂肪體細(xì)胞中合成，部分在腸道的表皮細(xì)胞中合成，也有少部分在血淋巴合成(Dziarski and Gupta, 2004)。昆蟲脂肪體由富含脂質(zhì)和糖原的松散細(xì)胞組成，除了具有能量?jī)?chǔ)存和卵黃質(zhì)前體合成的功能外，脂肪體還產(chǎn)生和分泌具有溶解活性的抗菌肽，以及體液免疫反應(yīng)的一些其他成分，是防御病原物的重要免疫器官(Hillyer, 2015)。研究表明果蠅PGRP-SC1,PGRP-SC2和PGRP-LB在幼蟲腸道中高表達(dá)，PGRP-SC2同時(shí)為脂肪體中Imd途徑的負(fù)調(diào)控因子(Costechareyreetal., 2016)。桔小實(shí)蠅BdPGRP-SA和BdPGRP-SD在成蟲脂肪體內(nèi)高表達(dá)，其參與識(shí)別革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌，從而激活下游AMPs以應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染(Weietal., 2019)。果蠅PGRP-SB1在脂肪體內(nèi)大量產(chǎn)生，然后釋放到血淋巴中(Zaidman-Rémyetal., 2011)。本研究關(guān)注的桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1屬于短型PGRP基因，該基因在脂肪體中表達(dá)最高(圖3：B)，說明該基因可能通過脂肪體在昆蟲免疫中發(fā)揮重要作用。

昆蟲PGRP可識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖激活Toll途徑和Imd途徑(Hultmark, 2003; Hetru and Hoffmann, 2009)。在果蠅中，感染胡蘿卜軟腐歐文氏菌Erwiniacarotovora會(huì)誘導(dǎo)PGRP-SC1,PGRP-SC2和PGRP-LB表達(dá)(Costechareyreetal., 2016)。PGRP-SB1能被含有DAP型PGN的革蘭氏陰性細(xì)菌激活，而含有Lys型PGN的革蘭氏陽性細(xì)菌只能短暫且輕微地激活PGRP-SB1。在缺乏Imd途徑的突變果蠅中，革蘭氏陰性細(xì)菌也無法誘導(dǎo)PGRP-SB1的表達(dá)(Zaidman-Rémyetal., 2011)。在本研究中，在PGN-EB和PGN-SA誘導(dǎo)后，桔小實(shí)蠅BdPGRP-SB1表達(dá)量顯著增加，這表明BdPGRP-SB1可以被大腸桿菌和金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)(圖4)，大腸桿菌誘導(dǎo)倍數(shù)比金黃色葡萄球菌多，而大腸桿菌為含有DAP型PGN的革蘭氏陰性細(xì)菌(陳康康和呂志強(qiáng), 2014)，說明BdPGRP-SB1對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌更為敏感。

黑腹果蠅PGRP-LB和PGRP-SCs突變后飼喂胡蘿卜軟腐歐文氏菌，其存活率較野生型果蠅顯著降低(Paredesetal., 2011)。在桔小實(shí)蠅中，抑制BdPGRP-SA和BdPGRP-SD后侵染大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，桔小實(shí)蠅死亡率均顯著高于對(duì)照(Weietal., 2019)。在本研究中，用大腸桿菌感染后，注射dsBdPGRP-SB1的桔小實(shí)蠅成蟲存活率比對(duì)照降低了24%；用金黃色葡萄球菌感染后，注射dsBdPGRP-SB1的桔小實(shí)蠅成蟲存活率和對(duì)照相比無差異(圖5)，表明BdPGRP-SB1參與大腸桿菌的識(shí)別過程。兩種細(xì)菌的侵染結(jié)果表明，BdPGRP-SB1主要參與革蘭氏陰性細(xì)菌的識(shí)別，與BdPGRP-SB1序列分析可識(shí)別DAP型PGN的結(jié)果一致。但PGRP-SB1突變品系果蠅，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌的耐受力與野生型果蠅相似，PGRP-SB1的突變并沒有引起其對(duì)細(xì)菌的敏感性增加(Zaidman-Rémyetal., 2011)，可能因?yàn)椴煌锓N之間基因功能存在差異。

在昆蟲中，已鑒定出許多AMPs。果蠅被胡蘿卜軟腐歐文氏菌或大腸桿菌侵染時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)AMPs表達(dá)升高(Gobertetal., 2003)。果蠅中，抑制Imd通路的負(fù)調(diào)控因子PGRP-LB表達(dá)后，注射革蘭氏陰性細(xì)菌或其肽聚糖和氣管細(xì)胞毒素(tracheal cytotoxin, TCT)等惰性化合物，均能誘導(dǎo)diptericin表達(dá)量升高(Zaidman-Rémyetal., 2006)。不表達(dá)Imd通路的負(fù)調(diào)控因子Pirk, PGRP-LB和PGRP-SCs的果蠅在被細(xì)菌感染后，AMP的表達(dá)水平是野生型果蠅的8～10倍，表明免疫反應(yīng)受到負(fù)調(diào)節(jié)的高度限制(Paredesetal., 2011)。PGRP-SB1突變品系在感染無害李斯特菌Listeriainnocua(具有DAP型PGN的革蘭氏陽性細(xì)菌)24 h后和感染大腸桿菌6 h后，diptericin有輕微的上調(diào)，Imd途徑輕度的過度激活表明PGRP-SB1作為負(fù)調(diào)節(jié)因子起到一定作用，在大多數(shù)情況下可能被更有效的負(fù)調(diào)節(jié)劑(如PGRP-LB)所掩蓋(Zaidman-Rémyetal., 2011)。Attacin,diptericin,cecropin和defensin是昆蟲中常見的AMPs，且參與桔小實(shí)蠅免疫(Liuetal., 2017)。在本研究中，BdPGRP-SB1沉默后注射滅活大腸桿菌，attacin-A,defensin和diptericin3種抗菌肽基因表達(dá)水平顯著上升。Imd途徑的過度激活表明BdPGRP-SB1可能參與Imd途徑的負(fù)調(diào)控。研究表明，過表達(dá)Imd可激活抗菌肽基因的表達(dá)，同時(shí)Imd的過表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)果蠅有害(Georgeletal., 2001)；Imd途徑負(fù)調(diào)節(jié)因子可防止過度免疫對(duì)果蠅的傷害(Paredesetal., 2011)。干擾BdPGRP-SB1后，抗菌肽基因表達(dá)量上調(diào)(圖6)，Imd途徑被過度激活，導(dǎo)致桔小實(shí)蠅對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌敏感性增加，說明BdPGRP-SB1可能參與Imd途徑的負(fù)調(diào)控，以防止過度免疫對(duì)桔小實(shí)蠅的傷害。