綠盲蝽八個普通氣味受體基因的克隆及功能鑒定

李 彬, 張 賽, 王晨蕊, 王桂榮, 劉 楊

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京100193)

綠盲蝽Apolyguslucorum是我國黃河流域和長江流域為害棉花的優(yōu)勢盲蝽種類，具有包括棉花、玉米、葡萄、棗、蔬菜等農(nóng)作物在內(nèi)的200多種寄主植物，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的破壞。自1997年轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉在我國商業(yè)化種植以來，化學(xué)農(nóng)藥使用量大幅度減少，一方面增加了天敵昆蟲的種類和數(shù)量，加強了部分害蟲的自然調(diào)控作用，有效地控制了棉蚜的種群發(fā)展(Luetal., 2012)，另一方面天敵控制作用較差的害蟲如綠盲蝽上升為主要害蟲(Luetal., 2010)。綠盲蝽種群的暴發(fā)還波及其他寄主作物, 近年來在各類果樹、茶樹等其他作物上為害也十分嚴(yán)重。雖然近年間人們致力于利用生態(tài)學(xué)和生物防治等手段對綠盲蝽進行綜合防治，但由于綠盲蝽具有寄主范圍廣、寄主轉(zhuǎn)換行為、高遷移性等獨特的生物學(xué)特性，造成這些防治措施并沒有達到最佳效果(Lu and Wu, 2011)。目前我國對綠盲蝽的防控還主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，如何綠色防治綠盲蝽仍然是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的重要科學(xué)問題。

植物揮發(fā)物在植物與昆蟲的通訊作用中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以調(diào)控昆蟲的多種行為，如引起昆蟲對寄主植物的定向選擇，引導(dǎo)昆蟲尋找合適的產(chǎn)卵場所，影響昆蟲的交配行為等(杜家緯, 2001)。昆蟲對寄主植物的定向選擇是植物與昆蟲相互依存關(guān)系中最重要的行為之一。昆蟲通過自身的視覺器官、味覺器官、觸覺器官和嗅覺器官等各種感覺系統(tǒng)不斷收集來自植物的各種信息，從形狀、顏色、大小、化學(xué)性質(zhì)、形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面對植物進行綜合評價，最后做出寄主選擇(陸宴輝等, 2008)。在昆蟲諸多的感覺系統(tǒng)中靈敏的嗅覺系統(tǒng)發(fā)揮了決定作用。昆蟲主要通過對寄主植物揮發(fā)的氣味分子的識別來對寄主植物識別和定位。因此，準(zhǔn)確了解昆蟲對寄主植物揮發(fā)物的識別機制不僅可以在理論上闡明昆蟲嗅覺識別高度特異性的分子和神經(jīng)基礎(chǔ)，在應(yīng)用上還可以開發(fā)昆蟲行為調(diào)控劑用于害蟲的綠色防控。

昆蟲的嗅覺識別是一個復(fù)雜的過程，在外周神經(jīng)水平上主要通過分布在觸角上嗅覺感器中的一系列蛋白參與來完成，這些蛋白包括氣味受體(odorant receptor, OR)、氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, OBP)、離子型受體(ionotropic receptor, IR)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein, CSP)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)、尼曼匹克C2蛋白(Niemann-Pick proteins of class C2, NPC2)和氣味降解酶(odorant degrading enzyme, ODE)(Rutzler and Zwiebel, 2005; de Bruyne and Baker, 2008; Sato and Touhara, 2008; Zhuetal., 2018)，其中氣味受體發(fā)揮了核心作用。目前已知的昆蟲氣味受體分為2類：第1類為在不同昆蟲間高度保守且廣泛表達的非典型受體(olfactory receptor co-receptor, Orco)；第2類為種間高度變異的傳統(tǒng)氣味受體(conventional odorant receptor, Orx)(Mombaerts, 1999; Bentonetal., 2006)。Orx不單獨對氣味分子起識別作用，而是與Orco形成異源多聚體(Butterwicketal., 2018)，共同將環(huán)境中的小分子化學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺剐嵊X神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位，最終引起昆蟲作出相應(yīng)的行為活動(Larssonetal., 2004)。自1999年首次從黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中鑒定出昆蟲氣味受體以來，伴隨著一些模式昆蟲基因組數(shù)據(jù)的公布，一系列昆蟲氣味受體基因家族被鑒定出來。包括從果蠅基因組中鑒定出62個氣味受體基因(Clyneetal., 1999; Gao and Chess, 1999; Vosshalletal., 1999)。在家蠶Bombyxmori中鑒定出48個氣味受體基因(Sakuraietal., 2004; Nakagawaetal., 2005; Wanneretal., 2007)。隨著氣味受體基因陸續(xù)被鑒定，研究者們已經(jīng)從分子和細胞層面展開對昆蟲氣味受體功能的一系列研究。

研究綠盲蝽的氣味受體，有利于我們從分子層面深入了解綠盲蝽對寄主植物的嗅覺識別機制，為研制高效的引誘劑或驅(qū)避劑提供理論依據(jù)并開辟新途徑。在實驗室前期工作中，已通過綠盲蝽成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析獲得多條綠盲蝽氣味受體基因序列。本研究中我們篩選并克隆了其中8個綠盲蝽氣味受體基因，并對其表達模式和功能進行了研究，為研究綠盲蝽對寄主植物的識別機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與組織收集

實驗所用的綠盲蝽采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊試驗基地，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所實驗室中使用新鮮四季豆Phaseolusvulgaris和鮮食玉米Zeamays在塑料盒內(nèi)進行人工飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為28±1℃，相對濕度為60%～70%，光周期為16L∶8D。收集羽化3 d的綠盲蝽雌雄成蟲觸角、頭(無觸角)、胸、腹、足和翅6種組織，用液氮迅速冷凍，儲存于-70℃冰箱內(nèi)備用。以相同方式收集3組不同批次的昆蟲各組織樣品。

1.2 RNA提取與cDNA的合成

使用Trizol試劑(Invitrogen，美國)按照說明書提取1.1節(jié)3組不同批次綠盲蝽雌雄成蟲6種組織(觸角、無觸角的頭、胸、腹、足和翅)的總RNA。每組觸角、頭(無觸角)、胸、腹、足和翅的總RNA分別取自100，50，20，20，80和80頭羽化3 d的綠盲蝽成蟲。提取的總RNA通過NanoDrop 2000(NanoDrop Products，美國)來檢測濃度和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測質(zhì)量。取2 μg各個組織的RNA，以O(shè)ligo dT為引物，合成cDNA第1鏈，實驗操作依照First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，美國)使用手冊。此cDNA用作PCR和實時定量PCR(qPCR)的模板。

1.3 引物設(shè)計

基于實驗室前期對綠盲蝽成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組的測序和分析，我們選擇具有完整開放閱讀框的AlucOR9,AlucOR16,AlucOR38,AlucOR53,AlucOR55,AlucOR56,AlucOR57和AlucOR58進行基因克隆和功能驗證。在qPCR實驗中，選用綠盲蝽的持家基因AlucActin(GenBank登錄號: KU188517.1)為內(nèi)參基因(張志翔等, 2016)。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因克隆和qPCR引物，全部引物信息見表1。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究所用引物信息

1.4 基因克隆

以綠盲蝽觸角cDNA為模板，利用基因克隆特異性引物擴增AlucOR9,AlucOR16,AlucOR38,AlucOR53,AlucOR55,AlucOR56,AlucOR57,AlucOR58以及AlucOrco(GenBank登錄號: MN657161)的完整開放閱讀框序列。PCR反應(yīng)體系: 2×PrimeStar Mix 12.5 μL(含Mg2+)，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，加水至25 μL。在震蕩器上混勻，短暫離心，放入PCR儀中進行擴增。其反應(yīng)條件: 98 ℃預(yù)變性3 min; 98℃ 變性10 s, 55℃退火15 s, 72℃延伸90 s, 35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并將條帶進行膠回收。將回收后的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt克隆載體(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)上，然后轉(zhuǎn)入Trans-1-T1感受態(tài)細胞(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)內(nèi)，進行測序(華大基因，北京)。

1.5 序列分析

使用EXPASY(Expert Protein Analysis System)(http:∥www.expasy.org)的Translate tool(http:∥web.expasy.org/translate)將8條氣味受體基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。使用TOPCONS(http:∥topcons.net)進行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。使用DNAMAN(http:∥www.lynnon.com)軟件將AlucOR9, AlucOR16, AlucOR38, AlucOR53, AlucOR55, AlucOR56, AlucOR57和AlucOR58 的氨基酸序列進行比對。

1.6 qPCR檢測

利用qPCR檢測AlucOR9,AlucOR16,AlucOR38,AlucOR53,AlucOR55,AlucOR56,AlucOR57和AlucOR58的表達水平。采用2×Go Taq qPCR Master Mix(Promega, 美國)在實時熒光定量PCR儀iCycler iQ2(Bio-Rad，美國)上進行qPCR。反應(yīng)體系: 2×Go Taq qPCR Master Mix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 1.2節(jié)合成的cDNA 模板1 μL, RNase-free Water 8 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性15 s, 60℃退火1 min, 40個循環(huán)。所有樣品均使用獨立的RNA進行3次重復(fù)，內(nèi)參基因AlucActin。通過2-ΔΔCt值法來比較各個基因不同組織的相對表達量，計算公式如下: ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因; ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt參照物。得到的3套模板的2-ΔΔCt值作圖，并比較基因的相對表達量。

1.7 表達載體構(gòu)建和cRNA合成

將測序結(jié)果正確的各AlucOR基因經(jīng)ApaⅠ和NotⅠ雙酶切后，亞克隆到表達載體pT7Ts上(體系為6 μL雙酶切后的基因片段, 1 μL 10×T4 Ligase Buffer, 2 μL 雙酶切過的pT7Ts 載體和1 μL T4 Ligase，連接條件為22℃保持2 h)，連接體系轉(zhuǎn)入Trans-1-T1感受態(tài)細胞(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)內(nèi)。過夜培養(yǎng)后，挑取8個陽性克隆進行菌液PCR驗證，然后測序。驗證正確的重組質(zhì)粒，使用SmaⅠ進行單酶切質(zhì)粒線性化，利用mMESSAGE mMACHINET7(Ambion，美國)進行cRNA的合成。

1.8 氣味化合物

實驗中共使用56種氣味化合物，均來自百靈威和Sigma-Aldrich公司(純度≥95%)，見表2。實驗所用氣味化合物首先用DMSO配制成1 mol/L的儲備液，存儲在-20℃冰箱中備用。實驗前，使用1×Ringer(96 mmol/L NaCl, 2 mmol/L KCl, 5 mmol/L MgCl2, 0.8 mmol/L CaCl2和5 mmol/L HEPES, pH 7.6)溶液稀釋到濃度為10-4mol/L。為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確，每次實驗所用氣味化合物均是現(xiàn)用現(xiàn)配。

表2 本研究所用氣味化合物

1.9 爪蟾卵母細胞表達結(jié)合雙電極電壓鉗記錄

爪蟾卵母細胞表達和雙電極電壓鉗記錄方法參照前人的使用方法(Luetal., 2007; Wangetal., 2010)。將合成好的濃度為2 μg/μL的AlucOR和AlucOrcocRNA各1 μL混勻到一起，按照每個細胞注射27.6 nL的量注射到健康且成熟的爪蟾卵母細胞中。將注射好的爪蟾卵母細胞放在培養(yǎng)液(1×Ringer, 5% 馬血清，50 μg/mL四環(huán)素，100 μg/mL鏈霉素和50 μg/mL丙酮酸鈉)中以18℃恒溫培養(yǎng)3 d。然后用OC-725C雙電極電壓鉗(Warner，美國)記錄爪蟾卵母細胞對不同氣味揮發(fā)物刺激的反應(yīng)。通過數(shù)模轉(zhuǎn)化器Digidata 1440A和軟件pCLAMP 10.2(Axon，美國)獲取和分析具體的數(shù)據(jù)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

基因表達量結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，雌雄各組織之間表達量的差異采用SAS軟件LSD檢驗進行多重比較，利用one-way ANOVA的統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 綠盲蝽氣味受體基因的克隆和序列分析

根據(jù)實驗室前期對綠盲蝽成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序分析所得的結(jié)果，設(shè)計特異性克隆引物，克隆得到AlucOR9,AlucOR16,AlucOR38,AlucOR53,AlucOR55,AlucOR56,AlucOR57和AlucOR58的cDNA全長序列(GenBank登錄號: MN905538-MN905545)。這8個氣味受體基因的開放閱讀框全長范圍在1 131～1 312 bp，編碼376～437個氨基酸。利用TOPCONS預(yù)測發(fā)現(xiàn)8個氣味受體均具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，N末端位于細胞膜內(nèi)，C末端位于細胞膜外(圖1)。通過序列比對發(fā)現(xiàn)這8個氣味受體基因的氨基酸序列一致性在11.63%～64.23%。

2.2 8個氣味受體基因在綠盲蝽雌雄成蟲不同組織中的表達譜

利用qPCR方法檢測8個氣味受體基因在綠盲蝽雌、雄成蟲不同組織的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，這8個氣味受體基因均在成蟲觸角中高表達；除AlucOR38外，其他7個氣味受體基因在雌成蟲觸角中的表達量顯著高于在雄成蟲中的(P<0.05)(圖2)。

圖2 8個綠盲蝽氣味受體基因在成蟲組織中的表達譜

2.3 8個綠盲蝽氣味受體的功能分析

在爪蟾卵母細胞中分別將8個AlucOR分別與AlucOrco進行共表達，用雙電極電壓鉗系統(tǒng)記錄AlucOR/AlucOrco對共計56種測試氣味化合物的電生理反應(yīng)。電壓鉗記錄結(jié)果顯示，AlucOR57/AlucOrco對其中15種氣味化合物(苯甲醛、氧化石竹烯、庚醛、反-2-己烯醛、乙酸苯甲酯、桃金娘烯醛、4-乙基苯甲醛、乙酸壬酯、四氫芳樟醇、十三烷、反-3-己烯醇、2-丙烯酸丁酯、丙酸丁酯、乙酸辛酯和乙酸戊酯)有反應(yīng)(圖3)，對其余的氣味化合物無反應(yīng)；其他7個綠盲蝽氣味受體對56種測試氣味化合物均無反應(yīng)。

圖3 雙電極電壓鉗記錄的爪蟾卵母細胞共表達AlucOR57/AlucOrco對不同氣味化合物的反應(yīng)

3 討論

本研究克隆得到了8個綠盲蝽氣味受體的完整ORF序列，序列分析的結(jié)果顯示這8個氣味受體具有昆蟲氣味受體典型的結(jié)構(gòu)特征(Bentonetal., 2006; Leal, 2013)。序列比對的結(jié)果顯示綠盲蝽8個氣味受體的氨基酸序列一致性非常低，這一結(jié)果符合昆蟲氣味受體序列高度特異性的特征，也與我們以前關(guān)于綠盲蝽氣味受體的研究結(jié)果一致，暗示綠盲蝽的不同氣味受體在功能上也可能存在較大差異(Yanetal., 2015)。

氣味受體的功能與其表達模式具有密切的聯(lián)系(Kriegeretal., 2002; Legeaietal., 2011)，因此不同氣味受體在組織表達模式上存在很大差異。性信息素受體一般在雄蟲觸角內(nèi)高表達或特異性表達，而普通氣味受體的表達模式則變化很大。一些氣味受體可能在雌蟲觸角上高表達或特異表達，例如家蠶的BmOR19, BmOR30, BmOR45和BmOR47都在雌蟲觸角中高表達，且能識別芳樟醇、苯甲酸、2-苯乙醇和苯甲醛等植物揮發(fā)物，推測其可能參與雌蟲對產(chǎn)卵場所的選擇(Andersonetal., 2009)。很多氣味受體在雌雄成蟲觸角間具有相同的表達水平，如苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus的AlinOR8在雌雄成蟲觸角中均高表達，且對7種酯類、芳香族和醇類化合物有反應(yīng)，因此推測其可能參寄主植物的選擇(嚴(yán)曙瑋, 2015)。某些氣味受體還在觸角之外的其他組織中表達。qPCR結(jié)果(圖2)顯示8個綠盲蝽氣味受體基因均在觸角中高表達，暗示它們參與了綠盲蝽的嗅覺識別過程；而不同氣味受體基因在雌雄觸角中的表達存在明顯不同，雖然8個氣味受體基因在雌雄觸角中的表達量都很高，但其中7個氣味受體基因在雌蟲觸角中表達量均高于雄蟲觸角中的，暗示它們可能在雌蟲的嗅覺感受中發(fā)揮重要的作用。

利用爪蟾卵母細胞異源表達結(jié)合雙電極電壓鉗記錄系統(tǒng)，我們檢測了8個綠盲蝽氣味受體對56種氣味化合物的反應(yīng)。結(jié)果顯示只有AlucOR57對15種氣味化合物(苯甲醛、氧化石竹烯、庚醛、反-2-己烯醛、乙酸苯甲酯、桃金娘烯醛、4-乙基苯甲醛、乙酸壬酯、四氫芳樟醇、十三烷、反-3-己烯醇、2-丙烯酸丁酯、丙酸丁酯、乙酸辛酯和乙酸戊酯)有反應(yīng)，而其余7個氣味受體對這56種氣味化合物均無反應(yīng)(圖3)。AlucOR57可以識別的15種氣味化合物組分包括多種已知的綠盲蝽寄主植物揮發(fā)物，如潘洪生(2013)從綠盲蝽寄主植物的花期揮發(fā)物中鑒定出了2-丙烯酸丁酯和丙酸丁酯，這兩種化合物可以激活綠盲蝽雌雄成蟲觸角的電生理反應(yīng)。2-丙烯酸丁酯和丙酸丁酯混合物(3∶1)在田間對綠盲蝽顯示出很好的誘集效果(潘洪生等, 2014)。而對于綠盲蝽的近緣物種中黑盲蝽Adelphocorissuturalis、苜蓿盲蝽和三點盲蝽Adelphocorisfasciaticollis，2-丙烯酸丁酯和丙酸丁酯也有顯著的吸引作用(修春麗, 2014)。AlucOR57對多種植物揮發(fā)物均有反應(yīng)，我們推測該受體可能參與綠盲蝽對寄主植物的識別和定位。但以上推測仍需要進一步的RNAi或基因敲除實驗進行體內(nèi)功能和行為學(xué)實驗驗證。

除AlucOR57以外，我們檢測的其他7個綠盲蝽氣味受體對檢測的56種氣味化合物均無反應(yīng)(圖3)，這可能是由于我們檢測的氣味數(shù)量較少，這7個氣味受體的配體不在檢測的范圍之中。此外，在昆蟲體內(nèi)氣味受體對氣味分子的識別還需要其他蛋白包括氣味結(jié)合蛋白、化學(xué)感受蛋白、感覺神經(jīng)元膜蛋白以及NPC2蛋白的參與，而我們在進行體外功能檢測時并未加入這些蛋白，可能影響到氣味受體發(fā)揮其正常的功能。這幾個受體的具體功能如何，仍需后續(xù)試驗進行驗證。

根據(jù)本研究的結(jié)果，我們推測AlucOR57在綠盲蝽對寄主植物識別過程中發(fā)揮了重要功能，對此氣味受體的研究有助于我們進一步了解綠盲蝽識別寄主植物的分子機制，為研發(fā)高效環(huán)保的綠盲蝽行為調(diào)控劑提供理論指導(dǎo)，為綠盲蝽的綜合防治提供新思路和新方法。