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    柚皮素聯(lián)合5-FU對大腸癌細胞增殖和遷移的影響*

    2020-11-09 06:55:28周燕紅
    關鍵詞:柚皮素大腸癌抑制率

    周 躍,周燕紅

    (1.湖北科技學院藥學院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院五官醫(yī)學院)

    大腸癌 (colorectal cancer,CRC) 是一種高度侵襲性的人類惡性腫瘤,通常診斷時已為晚期[1]。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(international agency for research on cancer) 2018年估計,CRC已成為第三大最常見的惡性腫瘤和第二大癌癥死亡原因,全球每年約有180萬新病例和90萬人死亡[2]。目前,除手術外,CRC患者的治療主要依靠化療,尤其是晚期CRC患者。化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)一直是治療CRC的一線方案[3]。由于5-FU對正常細胞有毒性,患者治療時容易產(chǎn)生耐藥性和嚴重的副作用,在晚期CRC中5-FU單藥治療的總有效率被限制在10%~15%[4]。因此,迫切需要改進以5-FU為基礎的化療方法治療CRC。

    國內(nèi)外藥理研究表明,柚皮素(NAR)是一種具有多種生物活性的柑橘類黃酮類化合物,具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗病毒、神經(jīng)保護、腎保護、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、促進碳水化合物代謝等多種生物活性,被認為是癌癥的一種潛在治療藥物[5-6]。本實驗采用體外培養(yǎng)人大腸癌LoVo細胞的方式,來探討柚皮素與5-FU聯(lián)用對大腸癌LoVo細胞增殖、遷移的影響?,F(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人大腸癌LoVo細胞購自中國科學院細胞庫。柚皮素購自Sigma公司;5-FU購自MCE公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Procell公司;青鏈霉素和胎牛血清購自Gibco公司;CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自Beyotime 公司;Transwell小室購自Falcon公司。

    1.2 細胞培養(yǎng)

    將大腸癌LoVo細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640的完全培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng),待細胞的密度達到80%時,按1∶3的比例對細胞進行傳代。

    1.3 CCK-8法測定細胞增殖能力

    取處于對數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的細胞,用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度到5×104/mL,接入96孔板,每孔100μL細胞懸液,同時設空白組,37℃、5%CO2培養(yǎng)24h(在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100μL無菌PBS)。細胞貼壁后,棄去上清,分別加入柚皮素(0、100、200、400、600、800μmol/L)處理24、48、72h,5-FU(0、5、10、20、40、80、160、320μmol/L)處理48h,每組6個復孔,每孔加入20μL CCK-8試劑,置于37℃培養(yǎng)箱中4h。酶標儀450nm測定各孔吸光值OD。按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率(inhibitory rate,IR):IR%=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(正常對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

    1.4 藥物聯(lián)合作用評價

    將不同濃度的5-FU與柚皮素按1∶4固定比分別聯(lián)合用藥,柚皮素濃度為(2.5、5、10、20、40、80 μmol/L),5-FU濃度為(10、20、40、80、160、320 μmol/L),CCK-8測定各組增殖抑制率。采用Chou-Talalay方法[7],研究了柚皮素與5-FU之間的藥物相互作用,并利用Compusyn軟件計算了其聯(lián)合指數(shù)(CI)的結(jié)果,其中CI<1為協(xié)同作用,CI=1為添加作用,CI>1為拮抗作用。使用Compusyn 1.0軟件生成效應-聯(lián)合指數(shù)曲線,即Fa-CI圖,F(xiàn)a為藥物作用效應。

    1.5 Transwell測定細胞遷移能力

    將LoVo細胞分為4組:正常對照組、柚皮素組、5-FU組、柚皮素+5-FU組。①正常對照組:僅加含RPMI完全培養(yǎng)基;②柚皮素組:80μmol/L濃度的柚皮素作用;③5-FU組:20μmol/L濃度的5-FU;④柚皮素+5-FU組:80μmol/L柚皮素和20μmol/L的5-FU;各組的細胞作用時間為48h。將無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞,稀釋細胞濃度至3×105/mL,備用;在24孔板中預先加入800μL 10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基(含雙抗),并放入Transwell小室,在上室分別接入200μL各組細胞懸液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;取出Transwell小室,用PBS清洗,70%冰乙醇溶液固定細胞1h;用0.5%結(jié)晶紫染液染色,PBS清洗,用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移的細胞擦干凈,顯微鏡下觀察拍照。

    1.6 統(tǒng)計學方法

    2 結(jié) 果

    2.1 柚皮素、5-FU單獨用藥對LoVo細胞增殖的影響

    不同濃度柚皮素對LoVo細胞均有不同程度的抑制作用,并呈濃度-時間依賴性(P<0.05),見圖1。處理48h時后,與24h相比,柚皮素的細胞抑制顯著增強(P<0.05);處理72h時后,與48h相比,柚皮素細胞增殖抑制率無差異(P>0.05),因此,后續(xù)實驗確定48h為最佳的作用時間,見表1。5-FU 在48h的增殖抑制率也隨著濃度顯著上升,見圖2。48h時,柚皮素的IC50為329.30μmol/L,5-FU的IC50為87.61μmol/L。

    表1 柚皮素干預LoVo的細胞增殖抑制率

    圖1 柚皮素對LoVo細胞的增殖抑制作用(n=6)

    與對照組比較,**P<0.01;與前一濃度組相比,#P<0.05,n=6

    2.2 柚皮素聯(lián)合5-FU的對LoVo細胞的增殖抑制作用

    相對于單獨使用柚皮素或者5-FU,聯(lián)合用藥顯著增強LoVo細胞的增殖抑制率且各濃度下CI<1(見圖3、圖4),結(jié)果提示柚皮素聯(lián)合5-FU對LoVo細胞有協(xié)同抑制作用。5-FU (20μmol/L) + NAR(80μmol/L)的濃度組合,該濃度下柚皮素和5-FU聯(lián)合用藥組較單獨用藥組均有顯著性差異(P<0.01),且增殖抑制率接近聯(lián)合用藥的半數(shù)抑制率,提示這兩種濃度的組合抑制 LoVo細胞增殖作用比較明顯,并且具有較高協(xié)同效果(0.4≤CI<0.6)。見表2。

    聯(lián)合組與柚皮素組比較,##P<0.01;聯(lián)合組與5-FU組比較,**P<0.01

    圖4 柚皮素聯(lián)合5-FU對LoVo細胞的效應與聯(lián)合指數(shù)曲線

    表2 5-FU聯(lián)合柚皮素對LoVo細胞體外增殖48h的聯(lián)合用藥指數(shù)CI

    2.3 柚皮素聯(lián)合5-FU對LoVo細胞的遷移作用

    采用Transwell小室實驗對LoVo細胞的細胞遷移能力進行了分析。對照組、柚皮素(80μmol/L)、5-FU(20μmol/L)、聯(lián)合組分別作用細胞后,穿膜細胞數(shù)分別為(323.20±17.97)、(167.60±22.80)、(131.20±8.77)、(82.20±7.14)個。與正常對照組細胞相比,單純使用5-FU或柚皮素治療細胞遷移能力均下降(P<0.01),而聯(lián)合治療的兩個藥物較單獨用藥有更顯著的抑制細胞遷移能力(P<0.01)。見圖5。

    A.對照組 B.柚皮素組 C.5-FU組 D.柚皮素+5-FU組

    3 討 論

    目前,大腸癌依舊是常見的惡性腫瘤,晚期患者死亡率高,25%的患者在診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病[8]。目前CRC的治療以手術和化療為主。5-FU是大腸癌的常用化療藥物,以5-FU為主的聯(lián)合化療也是結(jié)直腸癌治療的常用方案,但是毒副作用與耐藥性限制其治療效果。眾多研究已表明大腸癌可以通過早期診斷和聯(lián)合化療提高生存率。研究一些天然化合物發(fā)現(xiàn)它們可能對傳統(tǒng)的細胞毒性治療敏感,增強藥物的有效濃度,加強兩者的聯(lián)合作用,或?qū)δ[瘤細胞產(chǎn)生特異性的細胞毒性作用,能降低抗腫瘤藥物的耐藥性,即使在高劑量下也可減輕其毒性作用[9]。中藥配合化療藥物治療大腸癌,不僅可以明顯減輕化療的副作用,提高患者耐藥性和改善患者氣血、增強療效,而且作為一種新療法,已逐漸進入結(jié)直腸癌的臨床治療中,在晚期患者的治療中療效顯著。因此,尋找高效、低毒的天然藥物降低化療藥物的毒性、增強其療效,成為大腸癌治療研究熱點。

    研究表明,柑橘類黃酮類化合物與化療藥物聯(lián)合治療對腫瘤細胞的生長也有很好的抑制效果,可以作為輔助化療藥物的來源[10]。柚皮素屬柑橘類黃酮類化合物,具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤等特性,能抑制皮膚癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌等多種癌癥,也具有化學預防、毒副作用小的性質(zhì),柚皮素也被認為是癌癥的一種潛在輔助化療藥物,能協(xié)同增加化療藥的抗癌效果[5]。如柚皮素和他莫昔芬聯(lián)合處理ER+型乳腺癌較單藥處理有顯著抗增殖、抑制細胞遷移及誘導細胞凋亡等作用[11]。柚皮素對前列腺癌細胞的增殖和遷移具有明顯的抑制作用,與紫杉醇聯(lián)用后對LNCaP前列腺癌細胞的生長有協(xié)同作用[12]。

    在本實驗中,我們評估了5-FU和天然化合物柚皮素聯(lián)合使用對大腸癌細胞增殖和遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種化合物的組合給藥方式,低劑量的5-FU,表現(xiàn)出良好的協(xié)同抗增殖作用,能有效抑制細胞的遷移能力,與已報道過的5-FU聯(lián)合其他化合物的抗癌結(jié)果相似[13-15]。

    綜上所述,柚皮素聯(lián)合5-FU可以有效抑制大腸癌增殖、遷移,但是其機制和體內(nèi)實驗效果仍需要深入進行探究。

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