小分子化合物小檗堿靶向CDK2抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生長的分子機制研究*

馬徐民，羅斌華，胡美純，王 華**

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院基礎(chǔ)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究中心)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是高發(fā)病率、高死亡率的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，是一類嚴重危害人類健康的疾病之一[1]。由于惡性程度高、諸多藥物無法透過血腦屏障等特點，目前對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療方法十分有限。并且，膠質(zhì)瘤對放化療等治療手段的耐受性較強，導(dǎo)致治療效果差，且治療后易復(fù)發(fā)，患者中位生存期較短[2]，因此，尋求一類有效的治療藥物已迫在眉睫。與傳統(tǒng)藥物相比，小分子具有副作用小、特異性高且能夠透過血腦屏障等優(yōu)勢，是目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物治療的研究熱點[3]。小檗堿(berberine)是從黃連植物的根莖中提取出的一種小分子活性物質(zhì)，又稱作黃連素，是一種異喹啉生物堿，臨床上作為一類降糖中藥用于糖尿病的治療；它對細菌性腸炎、惡性腫瘤也有較好的效果[4-6]；對乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌等諸多惡性腫瘤都有明顯抗腫瘤活性[7-9]，作用機制可能與p53、Bcl-2蛋白介導(dǎo)的信號通路有關(guān)。但是，小檗堿在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機制卻鮮有報道。CDK2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是真核生物中細胞分裂周期的重要調(diào)控因子。體內(nèi)CDK2水平的增高被認為與腫瘤患者預(yù)后差相關(guān)，這導(dǎo)致腫瘤細胞增殖不可控[10]。目前CDK2是腫瘤藥物篩選的潛在靶點，基于CDK2靶點篩選到的小分子以及多肽藥物已經(jīng)進入到臨床試驗中。通過分子對接發(fā)現(xiàn)，小檗堿能和CDK2的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合。而且小檗堿能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移以及克隆形成，下調(diào)腫瘤細胞CDK2水平。本文通過計算機模擬與實驗相結(jié)合，研究深入分子機制層面，為小檗堿治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床藥理作用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞：鼠源腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6由羅斌華教授饋贈。主要試劑：小檗堿購自Solarbio公司，青鏈霉素、兩性霉素購自北京索萊寶科技有限公司，MTT試劑購自碧云天生物公司，過硫酸銨(APS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)購自Sigma公司，胰蛋白酶、Loading buffer(5X)、ECL發(fā)光試劑盒、DMSO、MTT試劑、預(yù)染蛋白Marker購于碧云天生物公司，脫脂奶粉購于美國BD公司、PVDF膜購于美國Millipore公司，甘油、甲醇購于武漢中天化工公司，抗體均購于ABclonal。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測小檗堿對C6細胞增殖的抑制作用

收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100μL細胞懸液，鋪板使待測細胞調(diào)密度至5000個/孔，邊緣孔用無菌PBS填充。5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入濃度梯度的藥物，細胞貼壁后即加藥，前一天下午鋪板，次日上午加藥，5%CO2，37℃孵育72h。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液后每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值間接反映活細胞數(shù)目，以小檗堿濃度0μmol/L為對照組，其他所有實驗均按此原則進行。細胞存活率=(實驗組OD-對照組OD)/(對照組OD)，設(shè)定對照組存活率為1。實驗組存活率與之相比，若存活率小于1則藥物對細胞有抑制增殖作用；若大于1，藥物對細胞有促進增殖作用，實驗重復(fù)3次后將數(shù)據(jù)整理利用Graphpad prism軟件進行作圖分析。

1.2.2 細胞劃痕實驗測試藥物對C6細胞遷移的抑制作用

先用marker筆在6孔板背面用直尺劃線，每孔4條橫線，每孔加入5×105個細胞待貼壁。待細胞密度達到100%時用黃色移液器槍頭平行于背面的marker印跡劃橫線，用無菌PBS緩沖液清洗細胞3遍。分別加入不同濃度(0、1、5、10、25、50μmol/L)小檗堿，設(shè)陰性對照組。當對照組細胞遷移滿后，實驗停止，4%多聚甲醛固定細胞后拍照。Image J軟件進行數(shù)據(jù)測量和計算，細胞遷移率=(0h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%，實驗重復(fù)3次后將數(shù)據(jù)整理利用Graphpad prism軟件進行作圖分析。

1.2.3 平板克隆實驗檢驗小檗堿對C6細胞克隆形成的抑制作用

將細胞狀態(tài)較好并處在對數(shù)生長期的C6細胞，胰酶消化1～2min，1000rpm離心棄上清液，細胞計數(shù)。每孔2000個細胞接種于六孔板中，隔天給藥后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d左右。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，用PBS清洗細胞2次。加4%多聚甲醛固定液5mL固定細胞15min，去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染10～30min，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)，最后計算克隆形成率，Image J軟件計數(shù)并作圖分析，克隆形成率(對照組)=實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次后將數(shù)據(jù)整理利用Graphpad prism軟件進行作圖分析。

1.2.4 免疫蛋白印跡法(Western Blot)檢測小檗堿作用后CDK2的表達水平

小檗堿處理C6細胞后，對細胞裂解提取總蛋白。具體方法：去除培養(yǎng)基，用PBS涮洗，每皿加入50μL細胞裂解液(其中含有Cocktail、PMSF、NaVO3)，并使培養(yǎng)皿傾斜放入冰中10min使細胞裂解充分，將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5mL EP管中，使用冷凍高速離心機在4°C的條件下離心(12000rpm，10min)后將沉淀棄掉，上清液即為細胞總蛋白。利用BCA法測蛋白濃度，一抗4°C過夜，二抗常溫孵育1h，自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果，實驗重復(fù)3次后分析結(jié)果。

1.2.5 小檗堿與CDK2計算機模擬

本文采用Autodock Tool[11]進行計算機模擬。受體分子CDK2蛋白質(zhì)是從PDB數(shù)據(jù)庫中下載得到(PDB ID：2EXM)，剔除原有結(jié)構(gòu)中的配體和水分子。配體分子小檗堿由Chem Bio Office繪制并轉(zhuǎn)換成pdb文件；受體分子經(jīng)過加氫加電荷等處理后，設(shè)定Gridbox，進行格點計算得到格點文件；最后，將小檗堿與受體分子進行分子對接，得到10個不同的分子構(gòu)象。通過文獻中其他小分子抑制劑比對以及10個分子構(gòu)象結(jié)合自由能參數(shù)分析，最終確定分子對接的最佳構(gòu)象。

1.3 統(tǒng)計學方法

本研究采用Graphpad prism軟件進行數(shù)據(jù)處理并繪圖，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05可說明結(jié)果具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 小檗堿抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖及克隆形式

與對照組相比，小檗堿能夠明顯抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力(圖1～2，封三)。隨著小檗堿濃度的升高，C6細胞的增殖活力明顯下降(圖1A，封三)，當小檗堿濃度達到5μmol/L時，腫瘤細胞間隙增加，部分細胞出現(xiàn)皺縮，細胞存活率下降約25%。而在濃度為25μmol/L時，細胞存活率僅為50%。當濃度達到最大給藥濃度50μmol/L時，細胞存活率下降了75%左右(圖1B，封三)，這說明小檗堿對C6腫瘤細胞具有明顯的殺傷效果。

在克隆形成實驗中，不同濃度小檗堿處理C6細胞72h后，腫瘤細胞克隆形成率隨藥物濃度的升高也呈下降趨勢(圖2A，封三)。當濃度為5μmol/L時，細胞克隆形成率僅為50%。而當濃度為50μmol/L時，其克隆形成率為10%以下(圖2B，封三)。因此，小檗堿能夠有效抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移及克隆形成能力。

2.2 小檗堿能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力

細胞傷口愈合實驗所示如圖3A(封三)所示，當藥物處理48h后，對照組細胞已遷移滿，實驗停止，固定細胞后進行拍照。和對照組相比，在相同給藥時間下，C6細胞的遷移能力隨著藥物濃度的增高呈下降趨勢。在給藥12h，當小檗堿濃度為25μmol/L時，C6細胞的遷移能力降低約40%，在濃度為50μmol/L時，遷移能力可以降低80%以上(圖3B，封三)。因此，小檗堿能夠顯著抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力。

2.3 小檗堿下調(diào)C6膠質(zhì)瘤細胞CDK2蛋白表達水平

不同濃度的小檗堿處理C6膠質(zhì)瘤細胞72h后，利用Western Blot技術(shù)檢測CDK2蛋白的表達，CDK2蛋白隨著小檗堿濃度的增高而下降(圖4A)。對Western Blot條帶結(jié)果所進行灰度值統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，藥物濃度為10μmol/L時，CDK2的蛋白已下降50%以上(圖4B)。因此，小檗堿可下調(diào)C6細胞CDK2蛋白的表達。

A.不同濃度小檗堿可下調(diào)CDK2蛋白表達水平；B.Western Blot結(jié)果灰度值統(tǒng)計結(jié)果(n=3，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.4 小檗堿結(jié)合于CDK2的ATP結(jié)合區(qū)域

通過計算模擬發(fā)現(xiàn)，小檗堿與CDK2的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合(圖5B)。結(jié)合文獻以及分子構(gòu)象結(jié)合自由能最低原則，在分子對接得到的10個構(gòu)象中，第8個構(gòu)象是最優(yōu)構(gòu)象，其結(jié)合自由能為-7.71(表1)。CDK2中的疏水氨基酸Leu134、Phe80、Phe82、Val18和Ile10形成的疏水口袋將berbine錨定在ATP結(jié)合口袋中。并且，CDK2的極性氨基酸Asp145和Lys33側(cè)鏈能夠與小檗堿的甲氧基中的氧氫鍵結(jié)合，而His84與小檗堿喹嗪環(huán)中的兩個O具有氫鍵相互作用(圖5C)。并且，與其他CDK2小分子抑制劑的三級結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)，小檗堿的空間構(gòu)象與其他小分子類似，均是通過Leu134、Phe80、Phe82、Val18以及Ile10形成的疏水作用以及Asp145和Lys33形成的氫鍵作用進行結(jié)合(圖5D)。因此，疏水作用和氫鍵相互作用在berbine與CDK2的結(jié)合中起著重要作用。通過計算機模擬，可以為小檗堿靶向CDK2抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長提供理論依據(jù)。

A.CDK2蛋白晶體結(jié)構(gòu)，其N端具有ATP結(jié)合區(qū)域(PDB ID：2EXM)；B.小檗堿與CDK2的ATP區(qū)域結(jié)合；C.小檗堿位于Leu134、Ile10、Phe80和Phe82形成的疏水口袋中，并與Asp145、Lys33以及His84具有氫鍵結(jié)合作用；D.小檗堿與其他CDK2小分子抑制劑的分子構(gòu)象比對(PDB ID：1PYE，2DUV，2EXM，2VV9，3MY5)

表1 小檗堿與CDK2分子對接的分子構(gòu)象結(jié)合自由能及RMSD值

3 討 論

與傳統(tǒng)藥物相比，小分子靶向藥物對其所針對的腫瘤具有較為突出的療效，并且有耐受性好、毒性反應(yīng)較輕、可通過血腦屏障等優(yōu)勢[12]。小檗堿作為一種異喹啉生物堿，在自然界分布廣，有著良好的開發(fā)優(yōu)勢。腫瘤是由環(huán)境、遺傳、營養(yǎng)和飲食等多種不同因素相互作用引起的一類嚴重疾病，傳統(tǒng)臨床上針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療多采用手術(shù)切除并輔助放化療，但是由于放化療對正常細胞同時具有殺傷作用，副作用較大，通常治療后常并發(fā)嚴重不良反應(yīng)。目前在臨床上已經(jīng)廣泛使用的小分子靶向藥物，例如伊馬替尼、吉非替尼分別在慢性粒細胞白血病(CML)急變期與轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌都已取得顯著效果[13]。分子靶向性藥物的研究必定會有力的推動神經(jīng)膠質(zhì)瘤在臨床上的治療進程。

C6是一株高度惡性的鼠源神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，常用作膠質(zhì)瘤研究的細胞模型。CDK2蛋白的異常高表達與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其在細胞周期信號通路中是起著關(guān)鍵作用的蛋白之一，以CDK2蛋白為靶點設(shè)計抗腫瘤藥物已經(jīng)成為藥物的研究與開發(fā)的重要方向。本文分子對接結(jié)果顯示，小檗堿能夠與CDK2的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合，并且，實驗證實小檗堿對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移與克隆形成均具有抑制作用；Western Blot結(jié)果顯示，小檗堿通過下調(diào)CDK2對神經(jīng)膠質(zhì)瘤起抑制作用。結(jié)合小檗堿分子對接結(jié)果，我們推測，小檗堿很有可能是靶向CDK2，通過競爭性抑制ATP的結(jié)合，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長。然而，這些分子機制需要進一步深入研究。

總而言之，本研究把計算機模擬與實驗研究相結(jié)合，在細胞層面證實小檗堿對神經(jīng)膠質(zhì)瘤起抑制作用，并研究小檗堿對腫瘤細胞中CDK2蛋白表達的影響，這為小檗堿對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了理論依據(jù)，為小分子藥物小檗堿成為抗腫瘤靶向性藥物奠定了基礎(chǔ)。