薏仁米貯藏過程中油脂氧化規(guī)律及原因探究

李永富 張晶晶 史 鋒 黃金榮 陳正行

(江南大學(xué)食品學(xué)院；江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室1，無錫 214122)(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心2，無錫 214122)(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室3，無錫 214122)

薏仁米(coix seed)，又稱薏米、薏苡仁、六谷子等，是禾本科玉蜀黍族薏苡屬植物薏苡的種仁[1]。薏仁米籽粒由包括胚乳、胚芽和皮層三部分構(gòu)成，去掉胚芽和皮層后得到的就是薏仁米。薏仁米營養(yǎng)價值豐富且兼具藥理作用，素被譽為“世界禾本科植物之王”和“生命健康之禾”?！侗静菥V目》等相關(guān)醫(yī)書記錄，薏仁米具有強筋骨、健脾胃、消水腫、去風(fēng)濕、清肺等多種功效，中國衛(wèi)生部于1987年10月將薏仁米列入第一批藥食兼用名單[2]。薏仁米是我國最古老作物之一，在我國大部分地區(qū)都有種植，貴州種植面積最大，其次是云南，另外福建、遼寧、河北、廣東、海南等地均有少量種植[3]。在當今保健食品風(fēng)靡的時代，薏仁米深受消費者喜愛，目前我國的薏仁米產(chǎn)品主要有以薏仁米為原料制作成的酒、膨化食品、餅干、粥、飲品和醋等[4]。

但長期以來，薏仁米作為小品種雜糧作物，并未得到充分的利用和開發(fā)。與我國傳統(tǒng)主糧相比，薏仁米的脂肪質(zhì)量分數(shù)約5%，相當是大米和小麥的2～3倍[5]，其產(chǎn)品的貨架期較短，在貯藏過程中品質(zhì)易發(fā)生劣變，從而產(chǎn)生讓消費者不愉快的哈敗味，降低了薏仁米的營養(yǎng)及商業(yè)價值。張立慶等[6]在開發(fā)薏米飲品時發(fā)現(xiàn)薏仁米由于油脂氧化產(chǎn)生哈敗味，李美玲等[7]在開發(fā)薏仁米酸奶時也同樣出現(xiàn)油脂氧化酸敗的現(xiàn)象，李長鳳[8]在研發(fā)薏米掛面時發(fā)現(xiàn)油脂氧化酸敗極大影響掛面的食用品質(zhì)，且貨架期不超過6個月?；诖祟惽闆r，楊鳳儀等[9]發(fā)現(xiàn)低溫真空包裝方式能夠?qū)⑥踩拭椎谋ｕr期由2個月延長至6個月及以上。陳光靜等[10]發(fā)現(xiàn)薏仁米貯藏過程中異味主要是由于薏仁米油脂氧化產(chǎn)生的，且其二級氧化產(chǎn)物醛類化合物是產(chǎn)生異味的主要原因。雖然針對薏仁米貯藏保鮮方法已有不少研究，但僅僅是通過控制貯藏溫度、包裝方式和外加抗氧化劑的方式，還是無法達到長期保存的目的。因此，本實驗將研究分別用真空和自封袋包裝的薏仁米在37 ℃貯藏過程中油脂氧化各項指標的變化規(guī)律，并通過檢測R·信號強度、脂肪酶和脂肪氧化酶活性等指標來探究油脂氧化的原因，以期為延長薏仁米的貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏仁米：脫殼運輸至實驗室，及時預(yù)冷并儲存于-18 ℃冷凍冰箱中備用。

無水乙醇、氫氧化鉀、三油酸甘油酯、無水乙醚、丙酮、石油醚(分析純)、己醛標準品。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機，LXJ-IIB低速離心機，GC-2010氣相色譜儀，EMXplus-10/12電子自旋共振波譜儀，SCIONSQ-456-GC氣質(zhì)聯(lián)用儀，Avanti J-26XP高速冷凍離心機，UV-1800紫外-可見光分光光度計，ICAP TQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀。

1.3 方法

1.3.1 貯藏實驗設(shè)計

將購買的新鮮薏仁米分別以每180 g裝袋，共9袋，其中4袋用真空包裝，5袋用自封袋包裝，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，分別測定0、4、8周的脂肪酶、脂肪氧化酶活性和脂肪酸組成，以及0周的高活性二價金屬元素，其他理化指標每隔2周測定1次。

1.3.2 貯藏指標的測定

1.3.2.1 水分含量的測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》的直接干燥法進行測定。

1.3.2.2 AV的測定

參照GB/T 15684—2015《谷物碾磨制品脂肪酸值的測定》進行測定。

1.3.2.3 POV的測定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》的滴定法進行測定。

1.3.2.4 己醛含量的測定

通過頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)聯(lián)用進行測定[11]。以癸烷標準品作為內(nèi)標，用甲醇配制成1 mg/mL的內(nèi)標液。用95%乙醇將己醛標準品配制成100 μg/mL儲備液，均置于4 ℃冰箱中避光冷藏備用。將薏仁米樣品粉碎過100目篩，取1 g樣品粉末于氣相瓶中，加入5 mL去離子水和20 μL癸烷內(nèi)標液，振蕩器混勻，待測。另外，將己醛儲備液用去離子水稀釋至2 μg/mL，再向氣相瓶中加入5 mL稀釋后的標品溶液和20 μL癸烷內(nèi)標液，振蕩器混勻，待測。頂空氣相測定條件參照Mexis等[12]方法。

1.3.3 油脂氧化原因的探究

1.3.3.1 R·信號強度的測定

將薏仁米樣品粉碎過100目篩，精確稱取薏仁米粉(60.0±5.0) mg于直徑為9 mm的核磁管中，裝填過程中避免樣品粉末沾壁，裝填完畢后在桌面上輕敲，使樣品粉末在核磁管底部分布均勻，使用電子自旋共振波譜儀(ESR)進行R·信號強度的測定。

測定條件：中心磁場3 355 G，g因子為2.000 0，掃場寬度100 G，掃描時間20 s，微波功率20 mW。R·強度以磁場強度用3 355 G處的峰高與1 g樣品(干基)質(zhì)量的比值來表示。

1.3.3.2 脂肪酶活性的測定

脂肪酶活性參照GB/T 5523—2008《糧油檢驗糧食、油料的脂肪酶活動度的測定》進行測定并有所改動。將薏仁米樣品分別粉碎過100目，稱取1 g樣品，0.5 g三油酸甘油酯和少量石英砂，在研缽中混合均勻，再加入2.5 mL磷酸緩沖液，研磨成勻漿狀，將其轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，用2.5 mL去離子水清洗研缽，使勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中，于30 ℃培養(yǎng)24 h。取出后加入25 mL乙醇乙醚混合液振蕩，靜置1～2 min，3 500 r/min離心5 min后得12.5 mL上清液，用0.01 mol/L KOH乙醇溶液滴定至pH=8為終點，計算脂肪酶活性。脂肪酶活性以中和1 g樣品(干基)中生成游離脂肪酸所消耗的氫氧化鉀的毫克數(shù)表示。

1.3.3.3 脂肪氧化酶活性的測定[13]

底物配制: 0.5 mL 吐溫60中加10 mL 0.2 mol/L pH 9.0 硼酸緩沖液， 混勻溶解，再逐滴加入0.4 mL 亞油酸(化學(xué)純)，形成乳濁液后滴加10% NaOH 0.5 mL，使全部溶解，溶液透明無色后，再加90 mL上述硼酸緩沖液。取此溶液20 mL，加上述硼酸緩沖液定容到100 mL，避光冷藏備用。使用前，再將此溶液用硼酸緩沖液稀釋40倍。

酶粗提液: 取過40目篩的薏仁米樣品1 g，加25 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.5)，4 ℃搖床振蕩提取30 min，8 000 r/min 離心10 min，取上清，冷藏備用。

測定方法：取底物2.8 mL，酶液0.2 mL，測定時混合均勻，空白為不加酶液的底物，立即在234 nm處觀察OD值的變化，記錄1 min內(nèi)(0 s和60 s)OD值變化數(shù)據(jù)，重復(fù)3次實驗。

脂肪氧化酶活力計算：在25 ℃，pH 9.0，反應(yīng)時間1 min的條件下，以亞油酸為底物的3 mL 反應(yīng)體系于234 nm處的吸光值增加0.001 計為一個活力單位，計算公式：

式中：EALOX為脂肪氧化酶活力/U/(g·min)；OD60’為第60 s時生成過氧化物的吸光值；OD0’為第0 s時生成過氧化物的吸光值。

1.3.3.4 霉菌含量的測定

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》進行測定。

1.3.3.5 脂肪酸組成的測定

脂肪酸組成通過氣相色譜法測定。氣相色譜測定條件參照李詩煒[14]的方法。

脂肪提?。簩⑥踩拭追鬯檫^60目篩，稱取薏仁米粉3 g左右，利用脂肪抽提器在70 ℃條件下用無水乙醚回流抽提3 h。

脂肪酸甲酯化：脂肪酸甲酯化方法參照王超群等[15]的方法。索氏抽提粗脂肪60～80 mg，加2 mL 0.5 mol/L NaOH甲醇溶液，振蕩2～3次之后，60 ℃水浴30 min。冷卻后加2 mL 25%三氟化硼甲醇溶液，60 ℃水浴20 min。冷卻后加2 mL正己烷和2 mL飽和NaCl溶液，振蕩萃取分層，取上層液體1 mL進行氣相分析。

1.3.3.6 二價金屬元素含量的測定

二價金屬元素含量通過微波消解—電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定。儀器工作參數(shù)設(shè)定參照李寧濤[16]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007計算水分含量、脂肪酸值、過氧化值等指標的平均值和標準差，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差的形式表示。用Excel 2007和Origin 8.5共同繪制圖表，數(shù)據(jù)處理用SPSS 24.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏期間薏仁米的含水量變化

含水量是糧食貯藏過程中的基本監(jiān)測指標之一，可以反映糧食的生理活性和品質(zhì)狀態(tài)[17, 18]，同時也是其他指標測定的基礎(chǔ)。自封袋和真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間含水量的變化如圖1所示，由圖1可知，無論是真空還是自封袋包裝的薏仁米，其水分含量在前2周處于穩(wěn)定狀態(tài)，之后處于下降的趨勢，但在6～8周后水分含量均有所上升。兩種包裝方式下的含水量無明顯差異，由此說明包裝方式對水分含量變化的影響不大。水分含量的損失可能由于37 ℃下發(fā)生了水分的蒸發(fā)，貯藏后期水分上升的原因可能由于薏仁米在貯藏過程中產(chǎn)生的呼吸作用生成了水等產(chǎn)物。

圖1 自封袋和真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間含水量和脂肪酸值的變化

2.2 貯藏期間薏仁米的AV變化

油脂經(jīng)過水解后生成一系列游離脂肪酸，AV則是衡量糧食中游離脂肪酸的重要指標，可以反映薏米仁在貯藏過程中的品質(zhì)變化和劣變程度。自封袋和真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間脂肪酸值的變化如圖1所示，無論真空還是自封袋包裝，0～6周薏仁米的AV呈快速增長趨勢，由此可知，貯藏期間薏仁米發(fā)生了脂肪的水解酸敗，品質(zhì)不斷劣變；6～8周AV明顯下降，原因可能是游離脂肪酸被大量氧化生成了其他次級產(chǎn)物，或其存在形式(如結(jié)構(gòu)等)發(fā)生改變，難以檢測出來[19]。另外，真空和自封袋包裝下AV變化無顯著性差異，由此可知，包裝方式對薏仁米的AV變化影響不大，這與楊鳳儀等[9]的研究結(jié)論一致。

2.3 貯藏期間薏仁米的POV變化

油脂氧化的關(guān)鍵產(chǎn)物是氫過氧化物，POV則是判定氧化劣變程度的敏感指標之一。自封袋和真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間過氧化值的變化如圖2所示，在真空包裝下，POV在貯藏期間呈上下波動的穩(wěn)定狀態(tài)；而在自封袋包裝下，POV呈線性增長趨勢。真空包裝下POV保持相對穩(wěn)定，一方面可能是因為真空條件下氧氣濃度低，氧化反應(yīng)速率緩慢，另一方面可能因為反應(yīng)生成的氫過氧化物極不穩(wěn)定，當濃度達到一定時會自動氧化分解成小分子醛、酮等物質(zhì)?？傊?，真空包裝可有效抑制薏仁米儲藏期間POV的增大，即自封袋相比真空包裝更易加速油脂的氧化劣變，這與代來鑫等[20]的研究結(jié)論一致。

圖2 自封袋和真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間過氧化值和己醛含量的變化

2.4 貯藏期間薏仁米的己醛含量變化

薏仁米在貯藏期間會產(chǎn)生不愉快的異味，其主要成分是小分子醛、酮類物質(zhì)，如己醛、庚醛、壬酮等[11]，它們是油脂氧化的終極產(chǎn)物，故己醛含量可以作為衡量油脂氧化劣變程度的關(guān)鍵指標之一。自封袋和真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間己醛含量的變化如圖2所示，貯藏8周后，無論是真空還是自封袋包裝的薏仁米，己醛含量均呈上升的趨勢，說明氫過氧化物發(fā)生了進一步氧化分解。但自封袋包裝下的己醛含量明顯高于真空包裝，主要是因為真空條件下氧氣濃度較低，氫過氧化物生成速率緩慢，從而其下一級分解產(chǎn)物己醛的生成量較低。

2.5 貯藏期間薏仁米的R·信號強度變化

已有研究表明，油脂氧化反應(yīng)主要是由油脂的自動氧化和酶促氧化造成的，其中自動氧化占主導(dǎo)作用。自動氧化分為三個階段，引發(fā)期、傳遞期和終止期，每個階段都有著自由基的生成或消失，故自動氧化也稱為自由基鏈式反應(yīng)。酶促氧化中脂肪氧化酶只能作用于1,4—順,順—戊二烯基位置，且此基團位于脂肪酸的ω-8位，在脂肪氧化酶作用下脂肪酸的ω-8先失去質(zhì)子形成R·，而后進一步被氧化。究其本質(zhì)，油脂氧化的始發(fā)原因是R·的存在，為了減緩油脂氧化劣變程度，應(yīng)降低R·信號強度且盡可能保證在貯藏期間該強度維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。故探究薏仁米的R·信號強度變化是解釋油脂氧化最為關(guān)鍵的指標。ESR是一種快速檢測自由基的方法[21]，0周薏仁米烷基自由基信號強度的ESR光譜圖如3所示。

圖3 0周薏仁米烷基自由基信號強度的ESR光譜圖

自封袋包裝薏仁米的R·信號強度在0～2周發(fā)生明顯下降，可能是因為油脂氧化速率快，R·與氧氣大量結(jié)合生成烷氧基；2～8周無明顯變化，可能是因為自動氧化有R·的減少，同時也有新的R·生成，從而進行氧化反應(yīng)的循環(huán)。真空包裝薏仁米的R·信號強度在0～6周無明顯變化，可能是因為氧化速率慢，消耗的R·少；6～8周開始發(fā)生明顯下降，一方面可能是因為AV下降導(dǎo)致R·的來源減少，另一方面可能是在貯藏后期油脂氧化速率開始增大。由此說明在一定的貯藏期間內(nèi)真空包裝下的R·信號強度相對自封袋較穩(wěn)定，氧化速率較慢，但超過一定期限真空條件下仍能發(fā)生嚴重的油脂劣變。

2.6 貯藏期間薏仁米的脂肪酶和脂肪氧化酶活性變化

脂肪酶是第一個參與油脂分解代謝的限速酶[22]，可以調(diào)控脂肪由三酰甘油酯向脂肪酸轉(zhuǎn)化的速率，有研究表明，游離脂肪酸的增長速率與脂肪酶活性具有極顯著正相關(guān)性。另外，脂肪氧化酶是酶促氧化反應(yīng)中重要的催化介質(zhì)，能夠?qū)Ｒ淮呋?,4—順,順—戊二烯基的多不飽和脂肪酸，如亞油酸、亞麻酸等，將其加氧轉(zhuǎn)化為氫過氧化物，另外，王志海等[27]研究表明，在恒溫、恒濕的條件下貯存豆粉，正己醛的生成量與脂肪氧化酶的活性有明顯的線型關(guān)系。故探究薏仁米的脂肪相關(guān)酶活性變化是解釋油脂氧化的另一關(guān)鍵指標。

自封袋和真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間脂肪酶和脂肪氧化酶酶活的變化如圖4所示。由圖4可知，貯藏8周后，無論是真空還是自封袋包裝的薏仁米，其所含的脂肪酶和脂肪氧化酶活性均略有增大，且第4周和第8周的兩種酶活均無明顯差異，但真空包裝下的兩種酶活性均略低于自封袋包裝，由此可以解釋兩種包裝下薏仁米油脂氧化指標變化的規(guī)律和差異。

圖4 自封袋和真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間脂肪酶和脂肪氧化酶酶活的變化

2.7 貯藏期間薏仁米的霉菌含量變化

貯藏期間薏米中脂肪酶和脂肪氧化酶活性均保持穩(wěn)定或略有增大，故探究脂肪相關(guān)酶活性增大的原因是否由外界微生物所導(dǎo)致，是解釋油脂氧化的重要間接指標之一。其中霉菌是外源脂肪酶和脂肪氧化酶的主要來源[28]，檢測貯藏期間霉菌含量的變化可以一定程度上反映外源酶活性的大小。

貯藏初期霉菌含量180 CFU/g，2周后自封袋包裝的薏仁米的霉菌含量迅速降低至55 CFU/g，之后緩慢下降直至穩(wěn)定；而真空包裝的薏仁米的霉菌含量迅速降低至15 CFU/g，之后保持穩(wěn)定狀態(tài)。貯藏2周后霉菌突然急驟下降，可能由于水分活度下降到安全范圍0.85以下，不適宜霉菌的生存。另外，真空包裝薏仁米的霉菌含量下降幅度相較于自封袋包裝的大，由此可見真空包裝對霉菌有較好的抑制作用，主要原因是霉菌是好氧微生物?？傊?，無論是真空還是自封袋包裝，在貯藏期間薏仁米的霉菌含量始終維持在較低水平，故參與油脂氧化的酶主要是薏仁米的內(nèi)源酶，且酶活性的增大并不是由外源微生物所導(dǎo)致的。

2.8 貯藏期間薏仁米的脂肪酸組成變化

由研究表明，不飽和脂肪酸(UFA)較飽和脂肪酸(SFA)更易發(fā)生氧化反應(yīng)[29]，故探究薏仁米中游離脂肪酸的組成是解釋油脂氧化原因的重要指標之一。由結(jié)果可知，自封袋和真空包裝的薏仁米的脂肪酸主要由單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)組成，共占84.6%左右，其中油酸所占比例最大，其次是亞油酸。隨著貯藏時間的延長，薏仁米的脂肪酸組成發(fā)生了明顯變化，SFA的含量逐漸升高，UFA的含量逐漸下降，說明參與油脂氧化反應(yīng)的主要是UFA。自封袋包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間脂肪酸組成的變化見表1，可知，自封袋包裝下薏仁米的亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)分別下降了2.68%、6.40%，而油酸(C18∶1)相對上升了0.2%，表明共軛雙鍵越多則越容易氧化。真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間脂肪酸組成的變化見表2，可知，真空包裝下薏仁米中亞油酸和亞麻酸分別下降了0.12%和1.6%，PUFA的氧化速率遠小于自封袋包裝下的氧化速率，由此證明了真空條件更有利于油脂的穩(wěn)定性貯藏。

表1 自封袋包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間脂肪酸組成的變化

表2 真空包裝的薏仁米在37 ℃貯藏期間脂肪酸組成的變化

2.9 貯藏期間薏仁米的部分金屬元素含量

金屬離子(Fe、Cu、Mn等)的作用在于能夠縮短誘導(dǎo)期和提高氫過氧化物的分解速度[30，31]，Galeron等[32]研究表明，金屬離子是催化油脂氧化的強有力因素。將貯藏0天的薏仁米原料中部分金屬元素的含量與已知大米和小麥相應(yīng)金屬含量[33]進行比較對解釋薏仁米油脂易氧化現(xiàn)象具有重要意義。薏仁米、大米和小麥的部分金屬含量的比較見表3，由表3可知，薏米中金屬元素含量排序：Mg>Ca>Fe>Zn>Cu，與劉春蘭等[34]的結(jié)論一致，且Fe和Cu的含量均遠高于大米和小麥相應(yīng)的金屬含量，由此說明薏仁米更易發(fā)生油脂的氧化劣變。

表3 薏仁米、大米和小麥的部分金屬含量的比較

3 結(jié)論

隨著貯藏時間的延長，薏仁米的AV、POV、己醛含量逐漸上升，水分含量逐漸下降，在真空和自封袋的兩種包裝下均會發(fā)生不同程度的油脂氧化，且后者比前者劣變程度要嚴重。排除外界因素的影響，薏仁米發(fā)生油脂氧化的主要原因是R·、內(nèi)源脂肪酶和脂肪氧化酶的存在，且酶活性在貯藏過程中逐漸增大。另外，薏仁米中的UFA所占比例不斷下降，SFA所占比例不斷上升，說明R·的主要來源是油酸、亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸。除此之外，薏仁米所含二價金屬元素較多，其中Fe、Cu等具有助氧化劑作用的金屬元素含量高于普通大米、小麥等谷物。因此，僅用真空包裝是無法達到長期保鮮的效果，為了延長薏仁米的貨架期，應(yīng)從消除R·和相關(guān)酶活性等方面入手。