幾種深海動物內(nèi)臟油脂提取及DHA、EPA含量分析

張德勇 許曉路 陸 胤

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

DHA(4，7，10，13，16，19二十二碳六烯酸)和EPA(5，8，11，14，17二十碳五烯酸)是ω-3長鏈多不飽和脂肪酸a-亞麻酸的代謝產(chǎn)物，人類不能自身合成，依賴從食品中攝取。DHA和EPA對人體的心血管健康非常有益，能清理血液中的膽固醇和甘油三酯、軟化血管、抑制血小板凝聚、抗血栓、舒張血管、調(diào)整血脂、升高HDL(高密度脂蛋白)、降低LDL(低密度脂蛋白)[1-3]。此外，研究顯示它們對于改善腦功能和視力，甚至在對抗糖尿病、炎癥、腎病、癌癥等方面也有功效[4-7]。DHA被證實是腦細胞線粒體、微粒體和突觸體的基本元件，直接影響人的生長發(fā)育，在大腦和視網(wǎng)膜中含量很高，是人體腦部、眼部各神經(jīng)系統(tǒng)防御系統(tǒng)的主要成分[1]。

目前獲取DHA、EPA的一個重要來源就是海洋動物，深海動物中的EPA和DHA的含量遠高于其他普通食物。我國有漫長的海岸線，海洋水產(chǎn)品資源非常豐富。據(jù)統(tǒng)計，我國海洋魚類約有1 700余種、沿海藻類約2 000種、蝦蟹類近300種、經(jīng)濟軟體動物約200種。這些海洋動物蘊含的不飽和脂肪酸資源數(shù)量非?？捎^。另外，與發(fā)達國家相比，我國對于這些豐富的海洋動物資源的開發(fā)利用還不充分，尤其在高附加值的深加工方面相對薄弱，在醫(yī)藥保健領(lǐng)域的規(guī)?；瘧?yīng)用亟待提高。在以往關(guān)于DHA、EPA的提取研究中，更多集中在魚類上，而對于非魚類的深海動物如螃蟹、章魚等未予重視[8, 9]。

不同于以往集中于魚類研究，本研究選取了幾種非魚類的深海動物作為主要材料，首先從其內(nèi)臟中提取油脂，然后用氣相色譜法分析油脂中DHA、EPA的含量。旨在探究不同的海洋動物體內(nèi)在多不飽和脂肪酸方面的營養(yǎng)價值差異，為開發(fā)醫(yī)藥或保健食品提供依據(jù)，以利于更科學(xué)合理地開發(fā)利用海洋動物資源。

1 材料與方法

1.1 試劑及生物材料

正己烷、甲醇、尿素、氫氧化鉀等試劑均為分析純，EPA-甲酯(C20∶5)、DHA-甲酯(C22∶6)標準品(純度≥99%)，GC-2014氣相色譜儀，6種海洋動物材料多為食品加工過程中產(chǎn)生的廢棄內(nèi)臟、殘肢(表1)。

1.2 不同海洋動物內(nèi)臟的油脂提取

魷魚內(nèi)臟組織被隨機切分成小份，每份約20 g，在恒溫水浴箱中設(shè)置不同的溫度進行隔水蒸煮，溫度為90 ℃、45 min，期間不時進行搖動。蒸煮結(jié)束后6 000 r/min離心15 min以分離油相與水相，收集油相即為粗油脂[10]。

表1 6種海洋動物

1.3 粗油脂中的多不飽和脂肪酸富集

將尿素加入到95%的乙醇中，加熱到45 ℃攪拌2 h，待溶液飽和后將其等量的分成三組并加入分別三組質(zhì)量相同的10 g油脂，繼續(xù)攪拌1 h；停止攪拌，自然冷卻到室溫；轉(zhuǎn)入低溫下靜置數(shù)小時，以便包合反應(yīng)充分進行；迅速在布氏漏斗上抽濾，液相移至梨形瓶中進行50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇，再進行水洗分液，有機相中加入少量無水硫酸鈉去除水分，即得富集產(chǎn)物[11, 12]。

1.4 氣相色譜法(GC)分析油脂中的DHA、EPA含量

1.4.1 氣相色譜(GC)條件

參考以往在其他魚油方面的研究，對氣相色譜方法進行優(yōu)化[8, 13-15]。氣相色譜基本條件為：色譜柱Agilent lechnologies，inc. 19091N-133(30 m×0.250 mm，0.5 μm)；柱溫箱溫度起始溫度180 ℃，以10 ℃/min 升至220 ℃，再以8 ℃/min 升至250 ℃，保持13 min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度270 ℃；載氣氮氣(≥99.99%)流速1.0 mL/min，空氣450 mL/min；氫氣40 mL/min；進樣量1.0 μL；分流比：20∶1。

1.4.2 標準品處理

以過濾后的正己烷配制EPA，DHA標準標準溶液。精確移取EPA-甲酯、DHA-甲酯標準品用容量瓶配制。一號容量瓶中為混合EPA、DHA標準溶液各2 mg/mL，采用倍比稀釋法配置系列濃度的混合標準樣，見表2。

1.4.3 樣品的處理

為與標準品一致，油脂樣品也要進行甲酯化反應(yīng)，即在堿性條件下與甲醇發(fā)生反應(yīng)。精確稱取油脂0.5 g于試管中，移取5 mL正己烷溶解試樣。另外稱取KOH 2.8 g溶解于水，轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶中，再稱取1.6 g甲醇加入其中，最后加水定容。再移取2 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液加入至各個試管中。封蓋后振搖1 min，加蒸餾水至試管頸部。棄去下層液體，再反復(fù)用少量蒸餾水進行洗滌并用吸管棄去水層，直至洗至中性，若正己烷層渾濁，以4 000 r/min離心5 min。吸取各個正己烷層用于上機測定。

表2 DHA和EPA標準品配制

1.4.4 樣品的進樣、測定

進樣操作按照氣相色譜的操作要求進行。進樣時用微量進樣針準確吸取1.0 μL EPA-甲酯、DHA-甲酯的混合標樣或者待測試樣準備進樣，然后啟動工作站上的進樣功能鍵迅速進樣。啟動后進行色譜數(shù)據(jù)記錄。

1.4.5 精密度分析

用相對標準偏差(RSD)等來分析精密度。具體為選一份魷魚油脂樣品為材料，重復(fù)進樣5次，測得的EPA的峰面積響應(yīng)值，計算其相對標準偏差RSD。

1.4.6 回收率分析

精確稱取魷魚油脂樣品，分9份，每份0.15 g，分別加入不同量的10 mg/mL 濃度的EPA、DHA標準品，制備成低(EPA-甲酯900 μL、DHA-甲酯1 500 μL)、中(EPA-甲酯1 125 μL、DHA-甲酯1 875 μL)、高(EPA-甲酯1 350 μL、DHA-甲酯2 250 μL) 3個濃度水平。將上述材料與油脂樣品用正己烷定容至25 mL。然后，按甲酯化步驟處理、測定。計算回收率及相對標準偏差。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對氣相色譜法獲得的出峰時間和峰面積進行計算和記錄。然后統(tǒng)計不同種類油脂中的EPA和DHA含量，并分析不同種類之間的差異，組間差異在SPSS (V11.5)軟件中進行One-way ANOVA分析，以α=0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同動物內(nèi)臟的粗油脂得率

隔水蒸煮法對6種動物廢棄內(nèi)臟進行提取，均成功提取到粗油脂，其呈淺黃色，氣味微腥，無酸敗味。進一步計算出油率，出油率以油脂占內(nèi)臟的質(zhì)量比表示。各物種的出油率如表3所示?？梢钥闯?，這幾種動物內(nèi)臟的出油率在0.72%～6.23%之間，不同種類的差異性很大，尤其以青蟹的出油率最高，其次為魷魚、象拔蚌等也較高，鮑魚最低。

表3 各種動物內(nèi)臟材料的出油率

2.2 高不飽和脂肪酸富集

在尿脂比2∶1、結(jié)晶溫度0 ℃、結(jié)晶時間18 h的條件下，蒸發(fā)溫度采用40、45、50、55 ℃分別得到57%、66%、69%和72%的富集純度。EPA和DHA的總純度隨反應(yīng)溫度的升高而增大，在反應(yīng)溫度為55 ℃時，省去了保護操作，效果仍較為理想。但溫度升至60 ℃時，富集物顏色明顯加深，疑似出現(xiàn)部分變質(zhì)，故以55 ℃最佳。

2.3 EPA和DHA氣相出峰特征及回歸方程建立

如圖1所示，EPA-甲酯的出峰時間約在10 min后，DHA-甲酯的出峰時間約在接近14 min時。分別進樣1.0 μL條件下得到色譜圖，計算峰面積響應(yīng)值，然后分別以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標和峰面積響應(yīng)值(A)為縱坐標，建立標準曲線和回歸方程。EPA-甲酯、DHA-甲酯分別在2000 μg/mL以內(nèi)的范圍內(nèi)時，色譜峰面積與EPA、DHA甲酯含量線性關(guān)系良好，最終建立兩個線性回歸方程。

YEPA=5 971.3x+3.53；R2=0.999 1

(1)

YDHA=5 119.5x+3.95；R2=0.999 3

(2)

式中：x值為EPA-甲酯或DHA-甲酯質(zhì)量濃度/μg/mL，Y值為峰面積值。

圖1 EPA-甲酯和DHA-甲酯的吸收峰

2.4 氣相色譜法的精密度與回收率

精密度的結(jié)果是連續(xù)進樣5次，所測得的EPA的峰面積響應(yīng)值分別為7.12、6.99、7.10、6.90、7.12(×105)，平均值7.05(×105)，相對標準偏差RSD為0.98%，可見RSD小于1%，反映儀器和方法的精密度較為理想。

加標回收實驗結(jié)果見表4和表5。經(jīng)計算，EPA甲酯平均回收率是100.80%，RSD為1.86%；DHA平均回收率為98.84%，RSD為0.95%?？梢钥闯?，本方法規(guī)定條件下，2種脂肪酸的樣品回收率測試平均回收率在98.84%～100.80%，相對標準偏差小于2%，符合常規(guī)要求。

表4 EPA加標回收實驗結(jié)果

表5 DHA加標回收實驗結(jié)果

2.5 不同種類油脂中的EPA和DHA含量

根據(jù)前面優(yōu)化的氣相色譜條件，對各類粗油脂甲酯化后的樣品進行直接檢測，如果低于檢測限則富集后再測定。檢測結(jié)果(以EPA或DHA的甲酯形式計)見表6。EPA含量從高到低依次為青蟹、魷魚、象拔蚌、鮑魚、烏賊和梭子蟹。DHA的含量從高到底的品種依次為青蟹、鮑魚、烏賊、梭子蟹和象拔蚌。這些動物在這兩種不飽和脂肪酸的含量上差異懸殊，高的達到37.02 μg/mL，低的僅為0.15 μg/mL。

表6 粗油中EPA和DHA濃度測定結(jié)果

2.6 EPA、DHA含量與海水深度關(guān)系分析

為了分析油脂中的EPA和DHA含量是否與動物所活動的海水深度之間是否有一定的關(guān)聯(lián)性，我們調(diào)查了這些種類的海洋動物所棲息活動的海洋深度特征，按照從淺到深以次為：鮑魚(以5 m計)、象拔蚌(以10 m計)、魷魚(以45 m計)、青蟹(以55 m計)、梭子蟹(以200 m計)、烏賊(以500 m計)。如圖2所示，隨著海水深度的逐漸加深，EPA的含量先是上升，但到達一定程度后又轉(zhuǎn)而下降，因此二者并非簡單的正相關(guān)關(guān)系，而是以中間某個深度時EPA含量最高，即活動于約55 m深度的青蟹。如圖3所示，DHA的含量與海水深度之間也呈現(xiàn)類似現(xiàn)象，DHA含量隨海水深度的加深呈現(xiàn)先升后降的過程，以約45 m深度的魷魚含量最高。這一規(guī)律與以往在海洋魚類上的檢測到的情況很相似[8, 9]。

圖2 EPA含量與動物所處海水深度的相關(guān)性

圖3 DHA含量與動物所處海水深度的相關(guān)性

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了同時測定EPA和DHA的氣相色譜法，簡便高效，分析時間短、定量準確、結(jié)果重現(xiàn)性好，精密度和回收率均較為理想。本研究共采用了6種來自野生海洋動物的內(nèi)臟或殘肢等廢棄物為材料，進行了油脂的提取，且均檢測到了DHA和EPA，顯示了這些廢棄物有重要的資源開發(fā)利用價值。不同種類的海洋動物，出油率不同，油脂中的DHA和EPA含量也差別懸殊。在所檢測的6種動物中，出油率方面以青蟹最高，其次為魷魚；而油脂中又分別以魷魚和青蟹中的DHA和EPA含量最高。因此，綜合而言，這兩種動物最適合作為DHA和EPA的獲取來源。另外，對這幾種海洋動物油脂中的DHA和EPA含量與其生活的海水深度之間的關(guān)系分析揭示了一個特點，即不論EPA還是DHA在油脂中的含量均表現(xiàn)為生活于中等深度海水的生物中含量最高，過淺或過深的區(qū)域的種類反而是偏低的。不能簡單地認為深度越深，多不飽和脂肪酸的含量一定越高，這一結(jié)論為篩選富含EPA或DHA來源的海洋動物提供了參考。