探索黃芪，南、北沙參治療尿路上皮癌的潛在靶點及作用機制

鄭新龍 鄭素雅 林 根

（1.福建中醫(yī)藥大學，福建福州 350122；2.福州市第二醫(yī)院，福建福州 350007；3.福建省腫瘤醫(yī)院，福建福州 350014）

中醫(yī)認為肺熱傷津，氣化失宣可引起尿路疾病。采取黃芪-南沙參-北沙參（HNB）配伍氣陰雙補扶正抗癌，郁仁存等教授基于辨證后使用HNB配伍治療尿路上皮癌（包括膀胱癌）取得顯著療效[1-2]。隨著現(xiàn)代藥理學的發(fā)展，大量基礎研究在分子層面揭示中藥抗癌的機理，特別是通過免疫學研究發(fā)現(xiàn)扶正中藥都有不同程度的免疫促進作用[3]，這極大地支持中醫(yī)“扶正驅邪”的抗癌理念。中藥具有廣泛的生物學作用，已有證據(jù)表明其可能與調節(jié)腫瘤微環(huán)境及癌細胞的協(xié)同作用、增強機體免疫力有關[4-5]。本研究探索性研究HNB結合免疫檢查點抑制劑提高尿路上皮癌患者臨床獲益可能的潛在分子機制。

1 資料與方法

1.1 中藥有效成分篩選及靶基因獲取

從傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中鑒定黃芪，南、北沙參（HNB）的化學成分[6]，根據(jù)口服生物利用度（OB）＞30%和類藥性（DL）＞0.18 進行篩選[7]，得到HNB活性成分。選擇相關靶點（Related Targets）獲取HNB所有活性成分對應的靶基因。

1.2 獲取IMvigor210隊列患者的差異基因（DEG）

大 型2期 試 驗（IMvigor210）研 究PD-L1抑 制劑（atezolizumab）對轉移性尿路上皮癌的臨床活性（n=348）。使用Creative Commons 3.0許可證獲取完整軟件的文檔和數(shù)據(jù)包，從http：//research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies下載。R包limma[8]被用來識別差異基因，P＜0.05和| log 2（fold change）|＞0.5的基因被認為是顯著差異表達并和尿路上皮癌免疫治療療效差異相關的基因[9]。

1.3 構建網(wǎng)絡

將具有免疫治療療效差異的基因與篩選出的NBS（黃芪、南沙參、北沙參）活性成分對應的靶基因映射，建立活性成分與靶基因對應關系，得到活性成分以及關鍵靶基因。使用Cytoscape軟件（Version 3.7.0）構建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡。使用string在線工具構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用注釋、可視化和集成研究數(shù)據(jù)庫對生物過程、細胞成分和分子功能進行GO分析（DAVID，https ：//david.ncifcrf.gov，v6.8）。對基因功能類別富集分析（FDR 錯誤發(fā)現(xiàn)率＜0.05）并選擇前20個GO功能類別。KEGG分析FDR＜0.05認為通路具有統(tǒng)計學意義。選擇具有顯著途徑調節(jié)的基因用于基因途徑網(wǎng)絡分析。構建通路網(wǎng)絡以篩選HNB結合免疫治療的關鍵靶基因。

2 結果

2.1 黃芪，南、北沙參活性成分和靶基因

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中鑒定的化學成分（表1），分別篩出 9 個北沙參、 4 個南沙參和17個黃芪活性成分。

2.2 鑒定與免疫治療療效差異相關的基因

對尿路上皮癌細胞進行免疫治療后電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，分化明顯的為具有治療效果，未分化為無效，確定818個組間差異基因?；鹕綀D表示差異表達基因的分布，如圖1，其中482個基因下調，336個基因上調。注：橫坐標代表基因表達的倍數(shù)變化，縱坐標代表基因表達變化的統(tǒng)計顯著性；右邊（上調）和左邊（下調）表示明顯差異表達的基因。

2.3 構建網(wǎng)絡

表1 黃芪，南、北沙參活性成分表

選取中藥靶基因和差異基因的交集基因并構建“中藥-活性成分-基因”網(wǎng)絡圖。發(fā)現(xiàn)MOL000098（槲皮素，quercetin）基因最多（n=15），其次，MOL000378（黃芪異黃烷苷，7-O-methylisomucronulatol）和MOL000392（芒柄花黃素，formononetin）均作用在7個靶基因上。

2.4 確定HNB結合免疫治療的核心靶點

將HNB潛在靶基因PPI網(wǎng)絡和免疫治療療效差異基因PPI網(wǎng)絡合并，該網(wǎng)絡由853個節(jié)點和17841個邊組成（圖2-A），大于中位DC的節(jié)點核心候選靶基因PPI網(wǎng)絡[10]，包含417個節(jié)點和11117個邊（圖2-B）。BC值為500鑒定出75個靶基因，包含75個節(jié)點和1128個邊（圖2-C）。前5個基因分別為：TP53、AKT1、EP300、MDM2和CCND1，與其他相互作用的基因數(shù)目為分別為：66、53、51、50和49。

2.5 GO 功能富集分析

基于GO分析靶基因的生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF），根據(jù)校正后 P 值進行排序。生物學過程，細胞成分和分子功能方面包括有絲分裂細胞周期相變的調控、DNA代謝過程的調控、蛋白質去泛素化、p53類介體的信號轉導、凋亡信號通路的調節(jié)、DNA損傷檢查點、轉化生長因子β受體信號通路、Wnt信號通路、先天免疫應答激活信號轉導和調節(jié)成纖維細胞增殖等。

2.6 KEGG 通路富集分析

KEGG分析共富集 124條通路（FDR ＜0.05）（圖 3）。黃芪，南、北沙參干預免疫治療患者的信號通路包括細胞周期、膀胱癌、FoxO信號通路、癌癥中的MicroRNA、乳腺癌、PI3K-Akt（磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）信號通路、泛素介導的蛋白水解、癌癥中的轉錄失調、TGF-beta信號通路、Th17（輔助性T細胞17）細胞分化、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑、癌癥中的中央碳代謝等。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學探索扶正中藥聯(lián)合免疫抑制劑有益于尿路上皮癌患者的潛在可能機制。KEGG富集分析的TGF-beta信號通路和免疫治療抑制顯著相關；B細胞受體信號通路及T細胞受體信號通路的激活和免疫促進相關。此外，癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑和本研究相關度極高。采用生物信息學方法檢索 TCGA 數(shù)據(jù)庫中關于 FoxO3 在膀胱癌患者癌組織和正常膀胱組織中的表達水平并進行比較，結果提示 FoxO3 在膀胱癌組織中表達水平明顯下調，而這種下調水平在不同分期的膀胱癌組織中是一致的，說明 FoxO3 下調是膀胱癌早期事件，且不隨疾病的進展而改變。因此有必要進一步確認核心基因的免疫治療作用。綜上所述，基于網(wǎng)絡藥理學研究方法，通過構建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡，從多成分、多靶點、多通路闡釋人黃芪，南、北沙參和免疫治療結合抗癌的潛在機制?；诰W(wǎng)絡藥理學分析得到的活性成分與靶基因具有相關性，但不能明確活性成分對靶基因調控關系。一部分中藥活性成分與靶基因相互作用是通過計算機模擬得出，仍有待驗證。