宏基因組技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用探討

胡 敏，曲麗娜，卞立紅，任國領(lǐng)，張奕婷，王金龍

(大慶師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，黑龍江 大慶 163712)

1 引言

宏基因組，最初于1998年由Handelsman等提出，指一個(gè)環(huán)境中全部微生物基因組信息，包含可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的。宏基因組技術(shù)屬于高效的組學(xué)技術(shù)。2004年Handelsman[1]發(fā)現(xiàn)宏基因組技術(shù)可以通過對微生物的細(xì)胞直接提取的方法獲得。2010年Wong[1]發(fā)現(xiàn)宏基因組技術(shù)還可以用于研究基因群和酶編碼基因，用于研究生物合成過程的生物活性催化劑和次生物代謝物產(chǎn)量，比如生物活性化合物。目前宏基因組技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生、能源開發(fā)、生物技術(shù)、環(huán)境修復(fù)等方面。本文簡述了宏基因組技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用，包括藥物開發(fā)、人體微生物群落的研究和疾病的診斷和治療。

2 宏基因組基本技術(shù)

2.1 宏基因組 DNA 提取

常用的提取DNA的方法有直接裂解法和細(xì)胞提取法。直接裂解法可以通過物理途徑和化學(xué)途徑，可以利用超聲波、凍融法、表面活性劑、鹽和有機(jī)溶劑等對DNA進(jìn)行提取。細(xì)胞提取法通常采用相應(yīng)酶對細(xì)胞進(jìn)行處理，達(dá)到細(xì)胞破碎的目的。兩種方法各有利弊，其差異取決于細(xì)胞破壁方法。

2.2 宏基因組文庫構(gòu)建

提取后所得到的基因組DNA，經(jīng)過純化處理后進(jìn)行酶切，之后將DNA片段與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)移到生命力旺盛的傳代培養(yǎng)細(xì)胞中并進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過程稱為建庫，即構(gòu)建宏基因組文庫[1]。宿主細(xì)胞對轉(zhuǎn)移進(jìn)去的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)，根據(jù)基因功能篩選出所需要的宿主細(xì)胞。建立的宏基因組文庫包含了所有的微生物DNA信息(包括可培養(yǎng)或不可培養(yǎng))，有利于開發(fā)新型的生物活性物質(zhì)。

2.3 目的基因的篩選

隨著宏基因組技術(shù)的發(fā)展，其目的基因的篩選方法也增加了很多，但主要方法仍為功能篩選、序列篩選以及底物誘導(dǎo)基因表達(dá)等。序列篩選是利用PCR或探針直接對基因序列進(jìn)行擴(kuò)增或檢測；功能性篩選是對基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測篩選，目前檢測的基因功能有抗菌活性、酶活性以及溶血活性等；底物誘導(dǎo)基因表達(dá)的篩選方法是由于底物的存在，而引起目的基因的功能酶合成的檢測方法，這種方法在篩選活性酶相關(guān)基因中被利用。宏基因組操作步驟如圖1 。

圖1 宏基因組技術(shù)操作步驟

3 宏基因組技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 宏基因組技術(shù)在藥物開發(fā)方面的應(yīng)用

宏基因組藥物的開發(fā)大部分來源于微生物的次生代謝產(chǎn)物，特別是抗生素。在Doreen E等[2]的研究中，他們構(gòu)建了包括24545個(gè)克隆的宏基因組文庫，并對其進(jìn)行篩選，選取了其中3個(gè)克隆(p57g4、p214d2、p89c8)，對其進(jìn)行檢測與分析，檢測結(jié)果為妥布霉素和妥布霉素B，這兩種抗生素的抗菌活性較廣，具有廣譜抗菌活性。美國KOSAN科技公司利用宏基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一系列的天然產(chǎn)品，包括多柔比星、紅霉素、四環(huán)素、Rapamy cin和FK506。Rondon MR等[3]等進(jìn)行了宏基因組文庫的建立，并對其進(jìn)行篩選，選擇出了表達(dá)脂肪酶的克隆基因，發(fā)現(xiàn)其也具有抵抗細(xì)菌的功能。趙晶等[4]構(gòu)建并篩選南極土壤宏基因組文庫，得到具有抗腫瘤活性克隆子13株，運(yùn)用MTT法對活性較高的克隆子進(jìn)行測定，結(jié)果表明AE-3克隆子明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的生長。國外的一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)在研究宏基因組技術(shù)的非核糖體肽的生物合成，為生物藥物的開發(fā)提供了一個(gè)新的想法。

3.2 宏基因組技術(shù)在人體微生物群落研究中的應(yīng)用

一般來說，人的正常菌群在口腔、皮膚、呼吸道、尿道和胃腸道等處都有存在。正常菌群與人體健康密切相關(guān)。他們可以合成并幫助人體吸收一些必需氨基酸和維生素；處理人類飲食中一些難消化的成分，如植物多糖；占據(jù)人體不同的粘膜表面，產(chǎn)生天然抗生素，抑制有害菌的著落和生長等。目前已有許多關(guān)于傳統(tǒng)方法對人類正常菌群進(jìn)行研究，但需要純粹的微生物培養(yǎng)，這限制了對生物體正常菌群的了解，尤其是對不可培養(yǎng)的微生物。宏基因組學(xué)克服了傳統(tǒng)方法的局限性。它既可以研究微生物組成和數(shù)量，也可以了解微生物群落本身與微生物環(huán)境中寄主的進(jìn)化關(guān)系、功能基因的分布及其對人類健康的影響。

3.2.1 在腸道微生物方面的研究

利用宏基因組技術(shù)對比研究了節(jié)段性回腸炎患者和正常人腸道中微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)患者腸道中微生物多樣性顯著降低，尤其硬壁菌門的細(xì)菌種類明顯減少[5]，表明人體腸道微生物多樣性與人體健康相互關(guān)聯(lián)?？茖W(xué)家建立人與動(dòng)物腸道微生物群宏基因組的對比，并對其代謝特征進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌感染可能引起肥厚，腸道內(nèi)的陰溝腸桿菌可能會(huì)導(dǎo)致肥胖；Ⅱ型糖尿病不只與糖代謝異常有關(guān)，也與菌群失調(diào)有關(guān)，腸道內(nèi)某些種類的乳酸菌可能影響糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[6]；在化療患者中研究腸道菌群，發(fā)現(xiàn)化療患者的腸道菌群可以通過損傷的腸道黏膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)從而刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生，協(xié)助殺傷腫瘤細(xì)胞，結(jié)果表明某些種類的腸道菌群可能導(dǎo)致腸癌的發(fā)生，但現(xiàn)在研究仍不能明確癌癥與腸道菌群的因果關(guān)系[7]。在余佳文[8]研究中認(rèn)為，人類和動(dòng)物體內(nèi)存在很多適合微生物生存的區(qū)域，例如腸道內(nèi)、口腔以及皮膚表面，宏基因組學(xué)的方法可以用來研究這些區(qū)域中的微生物，特別是在疾病治療上，可以用這種方法來實(shí)現(xiàn)對病人病情變化的觀察和治療過程中治療計(jì)劃的糾正，達(dá)到醫(yī)治手段能夠及時(shí)針對病癥的作用。

3.2.2 在口腔微生物方面的研究

Ling等[9]通過研究無齲兒童和患齲兒童齦上菌斑群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)纖毛菌、鏈球菌、放線菌、毗鄰貧養(yǎng)菌、硫單胞菌和韋榮菌組成的群落與齲病有顯著的相關(guān)性，可以從未患齲個(gè)體的微生物群組中尋找有效的抗菌肽和益生菌作為新型的抗齲藥物；Colombo等對牙周炎患者的進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在頑固性和可治療性牙周炎患者齦下菌斑的細(xì)菌種類比健康人多很多，且與健康人相比較還具有更多的牙周炎致病菌，表明牙周炎致病菌與慢性牙周炎相關(guān)；鄧盟等[10]對口腔扁平細(xì)胞癌患者的唾液微生物組進(jìn)行研究，獲得了8門微生物，提示口腔癌伴隨有口腔微生物組的結(jié)構(gòu)的改變，并對口腔細(xì)菌群體中的耐藥基因進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的耐四環(huán)素基因tet32 ，其能夠使四環(huán)素失活，口腔微生物組或許可以用于口腔癌的早期診斷。

3.3 宏基因組技術(shù)在疾病診斷與治療方面的應(yīng)用

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的疾病得到攻克，但也有許多疾病還都沒有找到病因，對于那些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測不到病因的疾病被定義為未知病因疾病，這些疾病有較高的發(fā)病率和致死率，例如新生兒腹瀉，每年造成180萬人的致死，但至今沒有找到明確的致病病原體。許多諸如流感樣疾病、新生兒腹瀉、阿爾茨海默病、各種形式腫瘤以及其它未知病因疾病都將受益于宏基因組學(xué)，這也將開啟其在公共衛(wèi)生和傳染病防治領(lǐng)域的應(yīng)用。

宏基因組技術(shù)可以對樣本的DNA直接測序，減少了傳統(tǒng)檢測方法的時(shí)間和提高了準(zhǔn)確性，快速找出致病病原體，為藥物和疫苗的研發(fā)提供了時(shí)間和基礎(chǔ)。菌血癥常常發(fā)生在ICU，因其發(fā)展速度快、并發(fā)癥多和死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害到了患者的生命安全，宏基因組技術(shù)可以快速找出致病原并進(jìn)行有效的抗菌治療。Long 等[17]對 78 例 ICU 患者的血漿分別進(jìn)行宏基因組二代測序和血培養(yǎng)，結(jié)果顯示，宏基因組二代測序方法的病原體檢出率為 30.77%，而血培養(yǎng)法僅為 12.82%，表明宏基因組技術(shù)在病原體檢測中具有更高的靈敏性。Abril 等[11]將 1 例膿毒癥患者血漿中的游離細(xì)菌 DNA 進(jìn)行宏基因組測序，24h內(nèi)便檢測出嗜二氧化碳噬細(xì)胞菌(Capnocytophaga canimorsus)基因序列高度富集，并使用 16s rRNA 測序進(jìn)行確認(rèn)，體現(xiàn)出宏基因組技術(shù)相對傳統(tǒng)檢測方法具有更高的效率。

傳染性疾病的預(yù)防要比治療顯得重要的多，預(yù)防未知病毒對人類的傳入是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，需要相匹配的病毒檢測和鑒定技術(shù)。在過去的十年，我們見證了宏基因組學(xué)技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域病毒學(xué)研究中的強(qiáng)大作用，流行病學(xué)研究表明很可能會(huì)有新的病毒從植物傳給人類，同時(shí)，我們也面臨恐怖分子進(jìn)行病毒襲擊的危險(xiǎn)，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)以它快速靈敏的特點(diǎn)，將會(huì)在病毒檢測中發(fā)揮傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)及序列依賴方法所不能起的強(qiáng)大力量。盡管宏基因組學(xué)技術(shù)還不是常規(guī)診斷方法的一部分，但是宏基因組學(xué)與人體存在的微生物基因組聯(lián)合使用，用于疾病預(yù)防以及診斷和治療具有重要的意義。

4 宏基因組技術(shù)研究展望

雖然宏基因組技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，但也有局限性。如果DNA提取方法不能獲得環(huán)境中所有微生物的全部基因組信息，就需要改進(jìn)樣品采集和檢測操作。此外，宏基因組技術(shù)涉及到復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析，這些數(shù)據(jù)分析屬于生物信息學(xué)的范疇，因此必須將宏基因組學(xué)與生物信息學(xué)相結(jié)合，可以消除傳統(tǒng)遺傳算法的缺點(diǎn)，如：效率低、成本高和時(shí)間成本等。總之，隨著檢測手段和高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，宏基因組技術(shù)的應(yīng)用范圍將會(huì)越來越廣泛，為生態(tài)環(huán)境以及人類的生存創(chuàng)造更好的條件，有利于更加保證人類合理利用自然、與自然和平相處的幸福健康的生活。

宏基因組在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究屬于剛剛起步階段，但研究前景令人看好。未來有望在以下方面取得突破并得到廣泛的應(yīng)用：不可培養(yǎng)的微生物耐藥機(jī)制以及在傳播中的作用；新型未知感染性疾病的診斷；特殊微生物群體致病機(jī)制的發(fā)現(xiàn)(例如生物膜)；女性陰道微生物群落的平衡與疾病的預(yù)防等。人類宏基因組的研究比較晚，應(yīng)該充分發(fā)揮現(xiàn)有的優(yōu)勢，不斷努力的深入研究克服阻礙，加快研究宏基因組在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)展。