污泥中糞大腸菌群測定的方法驗證

章維維，顧其波

(1.杭州嘉澍環(huán)境監(jiān)測有限公司，浙江 杭州 311100;2.杭州市交通運(yùn)輸行政執(zhí)法隊，浙江 杭州 310004)

1 引言

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和環(huán)保意識的增強(qiáng)，我國城鎮(zhèn)污水處理以及各類型工業(yè)污水處理事業(yè)不斷發(fā)展，隨之產(chǎn)生的污泥量也日益增加。污泥是在污水處理廠凈化污水過程中產(chǎn)生的沉淀物，其中含有大量需氧菌、兼性厭氧菌和異養(yǎng)菌[1]。污泥中的病原物進(jìn)入環(huán)境后，會污染周圍環(huán)境，威脅人類健康[2]。USEPA和歐盟(EU)都以糞大腸菌群數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)判斷污泥是否適用于土地利用[3]，同時糞大腸菌群菌值也是城鎮(zhèn)污水處理廠的污泥穩(wěn)定化控制指標(biāo)[4]。本文以杭州嘉澍環(huán)境監(jiān)測有限公司創(chuàng)新課題《污泥特性分析與分類處置技術(shù)研究》為依托，開展污泥中糞大腸菌群新項目驗證，按要求完成相關(guān)試驗分析，在此與同行做個簡單交流。

2 實驗部分

2.1 儀器和設(shè)備

采樣瓶(500 mL帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶)；高壓蒸汽滅菌器(115 ℃、121 ℃可調(diào))；恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋(允許溫度偏差36 ℃±1 ℃、44 ℃±0.5 ℃)；天平(感量0.001 g)；革蘭氏染色用有關(guān)器材；顯微鏡；振蕩器；一般實驗室常用儀器和設(shè)備。注：玻璃器皿及采樣器具試驗前要按無菌操作要求包扎，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。

2.2 試劑

乳糖膽鹽培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；伊紅美藍(lán)瓊脂、革蘭氏染色套裝(北京路橋技術(shù)股份有限公司)。

2.3 樣品采集、運(yùn)輸與保存

用于糞大腸菌群測定的采樣瓶，應(yīng)用可耐滅菌處理的廣口玻璃瓶。滅菌前，把具有玻璃塞的采樣瓶用鋁箔或厚的牛皮紙包裹，瓶頂和瓶頸都要裹好，在115 ℃經(jīng)高溫滅菌20 min。采得的泥樣應(yīng)立即送檢，時間不超過2 h，如不能立即送檢，應(yīng)置于冰箱內(nèi)，時間不超過24 h，否則將影響檢驗結(jié)果[5]。

2.4 檢測方法

稱取充分混勻污泥樣品10 g，放于裝有90 mL滅菌生理鹽水(.8%)的三角瓶內(nèi)，充分搖勻，制成1∶10均勻稀釋液。用1 mL滅菌吸管吸取1∶10菌液，注入9 mL滅菌試管內(nèi)，搖勻，制成1∶100均勻菌液。另取一支1 mL吸管，按照上述操作步驟，依次制10倍稀釋菌液，如此每遞增稀釋一次，即換用一支1 mL滅菌吸管。不同的污泥樣品，要選擇適宜的稀釋度。

分別用1 mL滅菌吸管吸取4個稀釋度污泥樣品，接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，置(44±0.5)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，此為初發(fā)酵試驗。將培養(yǎng)后，產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸的發(fā)酵管，用接種環(huán)取發(fā)酵液，劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置(36±1)℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后，用接種環(huán)挑取糞大腸菌群可疑菌落的一小部分，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。經(jīng)鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，挑取蓋該可疑菌落的另一部分接種乳糖發(fā)酵管，置(44±0.5)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，即證實有糞大腸菌群存在。通過查糞大腸菌值表，報告樣品糞大腸菌值/g(mL)。

2.5 糞大腸菌值

檢出一個糞大腸菌菌落形成單位的最小樣本量，系評價糞便無害化效果的重要衛(wèi)生指標(biāo)，菌值越大表明處理效果越好。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)限值

根據(jù)《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥泥質(zhì)》(GB 24188-2009)[6]中規(guī)定，污泥中糞大腸菌群菌值的限值見表1。

表1 泥質(zhì)基本控制指標(biāo)及限值

3 結(jié)果與討論

3.1 定性分析

3.1.1 空白對照

每次試驗均用無菌生理鹽水按照步驟進(jìn)行空白測定，測定結(jié)果均符合實驗要求，結(jié)果見表1。

3.1.2 陽性及陰性對照試驗

將大腸埃希氏菌CMCC44102和產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048按要求轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，制成一定濃度的菌懸液，分別取相應(yīng)體積的菌懸液按要求接種于試管中，然后按初發(fā)酵試驗和復(fù)發(fā)酵試驗要求培養(yǎng)，其結(jié)果顯示大腸埃希氏菌菌株呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，產(chǎn)氣腸桿菌菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，該結(jié)果符合驗證要求，結(jié)果見表2。

表2 定性分析測試

3.2 精密度檢驗

對低濃度(樣品1)、中濃度(樣品2)和高濃度(樣品3)3種污泥樣品，進(jìn)行了7次重復(fù)測定，并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，來考察方法的精密度。

結(jié)果顯示，樣品1的測定均值為10.8/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%；樣品2的測定均值為0.44/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%；樣品3的測定均值為0.0004/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0%。

以上低濃度(樣品1)、中濃度(樣品2)和高濃度(樣品3)的精密度結(jié)果符合驗證要求，具體測定結(jié)果見表3。

表3 方法精密度測試

3.3 實樣測定

對杭州市余杭區(qū)的6家污水處理廠污泥樣品進(jìn)行糞大腸菌群檢驗，結(jié)果表明：6家污水處理廠糞大腸菌群菌值為0.00004～0.04/g，除污水處理廠1外，其余5家污水處理廠糞大腸菌群菌值均小于0.01/g，結(jié)果見表4。

表4 6家污水處理廠污泥糞大腸菌群菌值

4 結(jié)論

通過以上對實樣及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品中的糞大腸菌群進(jìn)行分析測定的結(jié)果可以看出，采用方法(GB 7959-2012)測定污泥中的糞大腸菌群，其分析結(jié)果符合國家規(guī)定要求[7]。因此該方法適用于污泥中糞大腸菌群的測定，該公司具備分析該項目的能力。