應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)對(duì)不明原因智力低下/發(fā)育遲緩患兒的遺傳學(xué)分析*

熊卿圓, 岑錦明, 曾赤佳

1佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科(廣東佛山 528000)； 2佛山市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(廣東佛山 528000)

嬰幼兒不明原因的精神發(fā)育遲緩(mental retardation， MR)，也稱為智力落后(mental deficiency, MD)，為小兒常見的一種發(fā)育障礙(developmental delay，DD)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的一種可變表現(xiàn)，在人群中發(fā)生率接近3%[1]，可由遺傳、環(huán)境、圍生期缺氧窒息等引起[2]，其中遺傳因素約占40%。應(yīng)用傳統(tǒng)的G顯帶染色體核型分析檢出異常最多的嬰幼兒問題為：精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩(MR/DD)，孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorders，ASD)，包括先天性心臟病、腦發(fā)育不良、視覺聽覺異常等的先天發(fā)育異常(congenital anomalies，CA)[3-4]，但G顯帶核型分析只能檢出染色體5～10 Mb以上的異常，而熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)只能檢出特定的微小異常。只有低于6%的患者能通過傳統(tǒng)染色體核型分析和FISH技術(shù)檢測(cè)出異常[5]。染色體微陣列技術(shù)(chromosomal microarray analysis，CMA)又稱為“分子核型分析”， 可檢測(cè)染色體不平衡的拷貝數(shù)變異(copy number variant, CNV)，尤其是對(duì)于檢測(cè)染色體組微小缺失、重復(fù)等不平衡性重排具有突出優(yōu)勢(shì)。根據(jù)芯片設(shè)計(jì)與檢測(cè)原理，CMA可分為基于微陣列的比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization， aCGH)技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array， SNP array)技術(shù)[3]兩大類，其中SNP array除可檢出拷貝數(shù)變異外，還可檢出單親二倍體、雜合性缺失(LOH)、純合狀態(tài)(AOH)和三倍體。CNV可引起包括神經(jīng)發(fā)育性疾病、天性心臟病等先天發(fā)育異常，而CMA是先天發(fā)育異常和神經(jīng)發(fā)育性疾病診斷的一線檢測(cè)技術(shù)，但在提高異常檢出率的同時(shí)，也會(huì)檢出許多臨床意義不明確的變異(varians of unknown clinical significance，VOUS)，所以，對(duì)結(jié)果的解讀非常重要。本研究應(yīng)用染色體核型分析與單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)對(duì)168例不明原因的精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩患兒進(jìn)行掃描與分析，探討結(jié)果的解讀，以評(píng)估其遺傳病因，為進(jìn)一步治療及遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年7月至2019年6月來我院小兒神經(jīng)康復(fù)科門診及兒童保健門診就診的不明原因MR/DD患兒168例，根據(jù)MR/DD診斷及篩查標(biāo)準(zhǔn)[6]，排除已知明確病因的疾病，如有明確的染色體核型異常、遺傳代謝性疾病、圍生期異常所致的缺氧缺血性腦病等，所有病例先行G顯帶染色體核型分析，未見明顯異常或檢出平衡易位及未知來源片段的標(biāo)本再采用微陣列技術(shù)進(jìn)行分析。所有患兒均為臨床病例，入選患者家屬在入選時(shí)均被告知其研究方法及意義，做到知情同意，并得到了佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 樣本采集及預(yù)處理 在受試者安靜狀態(tài)下采集肝素抗凝及乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周血各2 mL。

1.3 G顯帶染色體核型分析 肝素抗凝外周血0.5 mL接種至5 mL含PHA的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，置37℃，5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68～72 h，加入100 μg/mL秋水仙素50 μL，作用12 min后收獲，將培養(yǎng)基移入15 mL離心管中，離心后吸去上清液，加入8 mL 0.75%KCl溶液低滲，置37℃水浴25 min，然后加入甲醇與冰乙酸按3∶1比例配制的固定液2 mL，混勻離心后吸去上清液，加入固定液8 mL，固定30 min后離心吸去上清液，再加入8 mL固定液重復(fù)固定一次，離心后視細(xì)胞的多少余留少許上清液制成合適濃度的細(xì)胞懸液。用吸管將細(xì)胞懸液混勻，吸取細(xì)胞懸液自10～20 cm高度滴在一干凈并預(yù)先冷卻的玻片上，在烤片機(jī)上緩慢烘干。65℃烤片3 h至過夜，老化后的玻片使用胰酶消化，吉姆薩母液用0.1 mol/L pH=7.4磷酸緩沖液稀釋，染色胰酶消化后的玻片，除去多余的染液，晾干，在油鏡下觀察。所有核型結(jié)果均按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(2016)》(《An International System for Human Cytogenetic Nomenclature 2016》)進(jìn)行描述。

1.4 CMA檢測(cè) 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周血送至廣州金域檢驗(yàn)中心或廣東省婦女兒童保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，進(jìn)行CMA檢測(cè)，兩機(jī)構(gòu)均采用Affymetrix公司配套檢測(cè)試劑盒及優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，嚴(yán)格按照質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DNA提取、酶切、連接、PCR、PCR產(chǎn)物純化、片段化、標(biāo)記、雜交等操作，使用 CytoScanTM750K芯片進(jìn)行全基因組范圍掃描，Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software；version 3.1.0.15進(jìn)行分析。并使用OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)、DECIPHER (Database of Chromosomal Imbalances and Phenotypes using Ensembl Resources)、 PubMed等數(shù)據(jù)庫對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果 168例患兒中，檢出染色體異常14例(8.33%)。14例異常患兒中，5例(35.71%)患兒有不同程度的特殊面部特征(眼臉外上斜、寬眼距、低鼻梁、高前額、小頭畸形等)，6例(42.85%)伴有其他先天發(fā)育異常，如先天性心臟病、腦發(fā)育不良、視覺聽覺異常、多指畸形，基始子宮，隱睪等。14例患兒核型分析結(jié)果及臨床表現(xiàn)見表1。

2.2 CMA檢測(cè)結(jié)果 168例患兒中，154例G顯帶染色體核型分析未見明顯異?；純杭氨?中1-5號(hào)患兒共159例患兒使用單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步掃描分析，26例(16.35%)檢出臨床相關(guān)變異，其中24例存在CNVs，2例為整條染色體或大片段純合子。檢出的CNVs中，微缺失16例，微重復(fù)8例。

表1 G顯帶染色體核型分析檢出異常病例結(jié)果及臨床表現(xiàn)

檢出致病的CNVs為18例，具體結(jié)果見表2。18例致病的20個(gè)CNVs中，大部分(16/20)>1 Mb，15例為微缺失，5例為微重復(fù)，微缺失是微重復(fù)的3倍；11例12個(gè)CNVs<5 Mb，13例有對(duì)應(yīng)的綜合征。

表2 SNP array 檢出致病性CNVs結(jié)果

檢出可能致病性變異4例，3例為微缺失，其中2例缺失片段在1～5 Mb之間，1例為純合子，純和片段>10 Mb。2例有對(duì)應(yīng)的綜合征。具體結(jié)果見表3。

表3 SNP array 檢出可能致病性變異結(jié)果

檢出臨床意義不明的變異(VOUS)4例，具體結(jié)果見表4，其中3例為微重復(fù)，且重復(fù)片段均≤1Mb，1例為純合子，純和部分片段均>10 Mb。

表4 SNP array檢出臨床意義不明的變異結(jié)果

26例異常中，2例患兒同時(shí)有MR/DD、ASD合并CA，且均檢出致病CNVs；8例患兒同時(shí)有MR/DD與CA，其中4例檢出致病CNVs，2例檢出可能致病CNVs，2例檢出VOUS；1例患兒同時(shí)有MR/DD與ASD，且檢出致病CNV；4例MR/DD患兒中，2例檢出致病CNVs，檢出可能致病CNVs和VOUS各1例； CA患兒則有3例檢出致病CNVs，2例檢出可能致病CNVs，1例檢出VOUS。

檢出異常最多的為7號(hào)染色體(4例)，檢出15、16、22、X號(hào)染色體異常均為2例；7q11.23與15q11.2均檢出2例，最大異常片段為包括X整條長臂的79.2Mb缺失(5號(hào)病例)。

3 討論

3.1 G顯帶染色體核型分析與SNP array異常檢出率分析 168例患兒中，通過傳統(tǒng)G顯帶染色體檢出異常14例(8.33%)，使用SNP array檢測(cè)的159例患兒中，檢出異常26例(16.35%)。通過染色體微陣列技術(shù)檢出而未能用傳統(tǒng)G顯帶染色體核型分析檢出或檢測(cè)為平衡易位的致病性CNV為16例(9.52%)，可能是由于傳統(tǒng)G顯帶染色體核型分析的分辨率為5～10 Mb，限制較大，與其相比，SNP array技術(shù)在檢測(cè)小片段DNA拷貝數(shù)異常方面優(yōu)勢(shì)明顯。

3.2 本研究SNP array結(jié)果分析及意義 檢出的致病性CNVs的18個(gè)病例中，有13例有對(duì)應(yīng)的已知綜合征，其中與Angleman綜合征(AS)和Prader-Willi綜合征(PWS)相關(guān)、與Williams-Beuren綜合征相關(guān)各2例，與7q末端缺失綜合征、22q11.2 重復(fù)綜合征、saethre-chotzen 綜合征、Cohen綜合征、Brunner 綜合征、Turner綜合征、16p11.2微缺失綜合征、16p13.11微缺失綜合征、DiGeorge綜合征相關(guān)病例各1例?？梢娔壳皵?shù)據(jù)庫所覆蓋的CNVs已較全面，大部分CNVs已被臨床所認(rèn)識(shí)，SNP array檢出結(jié)果可以很好地指導(dǎo)臨床診斷。

檢出的可能致病CNVs中，1例(4號(hào)病例)位于6p22-p24缺失致病區(qū)域內(nèi)，但不包含關(guān)鍵基因ATXN1和JARMR2，6p22-p24缺失主要表現(xiàn)為智力低下、語言發(fā)育遲緩、注意力缺陷等行為異常、特殊面容、多發(fā)畸形等[7]，但數(shù)據(jù)庫內(nèi)未見與本病例缺失片段完全一致的病例報(bào)道。1例(17號(hào)病例)包含重要功能基因ERBB4，一文獻(xiàn)報(bào)道ERBB4基因發(fā)生缺失可引起智力障礙，語言發(fā)育遲緩，多動(dòng)癥等臨床表現(xiàn)。Decipher數(shù)據(jù)庫分別報(bào)道3個(gè)病例(271941，267738和252228)與本病例缺失大小相似，均涉及ERBB4基因，且兩例為新生突變，臨床表現(xiàn)為智力低下和語言發(fā)育遲緩。ERBB4基因功能缺失也可引起肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclero)[8-10]。1例(25號(hào)病例)為15號(hào)染色體大片段純合子，包含了與AS/PWS相關(guān)基因[11]。1例(9號(hào)病例)包含4個(gè)基因，可能導(dǎo)致神經(jīng)類精神類疾病發(fā)生，如智力低下、自閉癥譜系疾病，癲癇和精神分裂癥等，其他表現(xiàn)為肌張力低下和骨骼發(fā)育異常等[12]。

檢出的臨床意義不明VOUS中，1例(6號(hào)病例)包含30個(gè)基因，但未見該區(qū)域相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。1例(10號(hào)病例)包含22個(gè)基因，Decipher數(shù)據(jù)報(bào)道三例相似病例，一例報(bào)告為可疑良性變異(286187)，兩例報(bào)告為臨床意義不明(294373,349736)。1例(13號(hào)病例)包含25個(gè)基因，與本片段相似重復(fù)病例相應(yīng)報(bào)道記載的臨床表現(xiàn)為智力低下、發(fā)育遲緩等(283139)。1例(16號(hào)病例)2號(hào)染色體發(fā)生大片段純合子現(xiàn)象，可能為2號(hào)部分純合，或整條2號(hào)染色體為單親二倍體(uniparental disomy，UPD)，無證據(jù)證明UPD(2)致病[13]。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢出致病的CNVs中，微缺失是微重復(fù)的3倍，可能致病CNVs中也有3/4為微缺失，而VOUS中，3/4為微重復(fù)，可以推測(cè)，微缺失比微重復(fù)更易致病，而微重復(fù)為VOUS的可能性較大。結(jié)合臨床數(shù)據(jù)和家族史信息能更好地分析CNV的遺傳模式，但在實(shí)際應(yīng)用中很難讓雙親都接受檢查，Iossifov等[14]認(rèn)為，新發(fā)的CNV比遺傳自親代的更易致病, 如本研究26號(hào)病例，其父親為表型正常的微重復(fù)(1q21.1q21.2(144034100-148662253)×3)攜帶者，其胞弟繼承了父親的基因型，暫未發(fā)現(xiàn)表型異常，而26號(hào)病例檢測(cè)出新發(fā)致病CNVs，與DiGeroge綜合征相關(guān)，該患兒表現(xiàn)為免疫力低下，出生至今多次因感染入院。另外，結(jié)果中檢出2例大片段純合子，可能為該染色體發(fā)生部分純合，也可能為整條染色體發(fā)生單親二倍體(UPD)，兩種均可能導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域內(nèi)隱性遺傳病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。但由于CMA只能檢測(cè)同源性UPD，而不能檢測(cè)異源性UPD[13]，所以更需要雙親進(jìn)行檢測(cè)，比對(duì)結(jié)果，以明確該染色體是部分純合還是整條染色體發(fā)生單親二倍體。所以，盡可能的完善家族史CMA信息對(duì)檢出CNVs性質(zhì)的判定非常有意義，也可更好地對(duì)患兒進(jìn)行診斷及相應(yīng)治療。

包含多個(gè)基因或已知致病基因的CNV比只包含少量基因或所包含的為功能未知基因的CNV更易致病，可能是由于基因的劑量敏感度所致，由此可推論，大片段CNVs可能比小片段CNVs更易引起明顯的臨床癥狀。缺失可能會(huì)引起單倍劑量不足，一些小片段的微缺失也會(huì)引起相應(yīng)的致病綜合征，如8q22.2缺失515kb，涉及基因VPS13B，與Cohen綜合征相關(guān)(22號(hào)病例)，該綜合征呈常染色體隱性遺傳，其典型臨床癥狀包括智力低下，產(chǎn)后小頭畸形,面容異常(毛發(fā)濃密,發(fā)際線低,眼瞼下垂,燒杯樣鼻,高腭弓等)，色素視網(wǎng)膜病變，近視，間斷性中性粒細(xì)胞減少等[15]。另外一些小的缺失也可能導(dǎo)致患病，如15q11.2缺失312kb，包含TUBGCP5、CYFIP1、NIPA2、NIPA1 基因[16-17]，可能導(dǎo)致精神類疾病發(fā)生，如智力低下、自閉癥譜系疾病，癲癇和精神分裂癥等，也可表現(xiàn)為肌張力低下和骨骼發(fā)育異常等[12]。而許多正常病例中檢出大片段重復(fù)卻不致病，甚至在正常人身上也可檢出的情況另重復(fù)的機(jī)制變得很難解釋，特別是若在相關(guān)基因調(diào)控區(qū)域或與臨床相關(guān)的基因上則更加復(fù)雜。

根據(jù)患兒的表型結(jié)果分類顯示，同時(shí)存在MR/DD與CA的患兒與檢出的致病CNVs最多(4例)，其次是CA(3例)，再次是MR/DD、ASD合并CA患兒與MR/DD患兒(均為2例)，最少是MR/DD合并ASD患兒(1例)，可見先天異常與精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩?fù)瑫r(shí)出現(xiàn)是染色體可能存在異常的一個(gè)重要的表現(xiàn)。結(jié)果中3例存在ASD患兒均檢出致病性CNVs，Iossifov等[14]表明，ASD患者更有可能攜帶新發(fā)且罕見的CNVs和基因水平的突變。Schaefer等[18]報(bào)道CMA可以在約10%的ASD病例中檢出有臨床意義的CNV，全基因組測(cè)序和全外顯子測(cè)序可能可以將ASD中陽性的檢出率提高10%～15%[19]，而CMA聯(lián)合WES可以診斷約20%的ASD[20]。因此，將來可能會(huì)逐漸將測(cè)序作為主要的檢測(cè)手段。

現(xiàn)在越來越多的實(shí)驗(yàn)室傾向于使用分辨率更高的CMA平臺(tái)，預(yù)計(jì)將發(fā)現(xiàn)更多的致病CNVs，而這也將同時(shí)導(dǎo)致VOUS的數(shù)量增加。所以除了要注重基因型-表型的相關(guān)性以外，還可依據(jù)CNVs的大小和類型、遺傳模式、基因型與表型之間的關(guān)系等來更好地解釋單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)所檢測(cè)到的CNVs結(jié)果，以更好地分析在整個(gè)基因組中的存在復(fù)雜相互作用的CNVs，為更多的不明原因MR/DD患兒提供明確的病因診斷，對(duì)深入研究MR/DD病因機(jī)制、患兒的預(yù)后及遺傳咨詢有重要的意義。