偏最小二乘方法在不同白酒香型判別分析中的應用

魏泉增，范江濤，劉嘉玲，宋麗君，李 瑞，謝玉鋒

（1.許昌學院 食品與生物工程學院，河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標識快檢技術重點實驗，河南 許昌 461000；3.哈爾濱學院 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150086）

傳統(tǒng)的白酒香型鑒別方法主要依靠品酒師憑借感官品評。醬香型、濃香型、清香型是我國主要的三大香型白酒，由于生產地域不同，使得不同產地的白酒具有風味成分眾多、香氣成分復雜的特點，給香型的辨別分析帶來困難。但近年來，隨著分析技術的發(fā)展，對白酒香味成分進行了深入研究[1-6]。范文來等[7]對洋河酒廠的藍色經典系列白酒進行分析，結果表明在濃香型白酒中認為重要的化合物如乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸等化合物并不是洋河藍色經典系列白酒的重要香氣成分[8]。孫細珍等[9]采用保留指數(shù)結合標準品比對法分別從現(xiàn)代工藝和傳統(tǒng)工藝小曲清香型白酒中鑒定出116種和121種揮發(fā)性成分，并通過化合物遺漏實驗尋找到了清香型白酒重要的風味物質。陳華明等[10]采用氣相色譜法對醬香型白酒中63種風味組分進行檢測，結合嗅閾值計算各樣品中風味組分的香氣活性值（odor active values，OAVs），確定29種主要風味組分進行主成分分析，確定醬香型白酒的主要香氣成分。目前采氣相色譜與質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）方法[11-13]對白酒香氣成分進行分析，所獲得的數(shù)據(jù)量較多[14]，數(shù)據(jù)之間的相關性高，處理起來相當困難，同種香型的白酒也存在明顯差異[15]。偏最小二乘回歸（partial least square，PLS）是近年來應用實際需要而產生和發(fā)展的一個具有廣泛使用性的新型多元統(tǒng)計分析方法，是多元線性回歸、主成分分析和典型相關分析的有機結合[16]。PLS能有效地解決樣本量少、自變量較多、相關性較高的數(shù)據(jù)模型，近年來在食品行業(yè)領域受到了極大的重視及應用[17-18]。

本實驗用氣相色譜技術測定不同香型白酒，將所獲得的信息轉化為數(shù)據(jù)矩陣，采用PLS對數(shù)據(jù)進行建模分析，以期建立一種白酒香型分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒（7個品牌，分別編號為NX1、NX2、NX3、NX4、NX5、NX6、NX7）每個品牌3個樣品，醬香型白酒（8個品牌，分別編號為JX1、JX2、JX3、JX4、JX5、JX6、JX7、JX8）每個品牌3個樣品，清香型白酒（7個品牌，分別編號為QX1、QX2、QX3、QX4、QX5、QX6、QX7）每個品牌3個樣品：市售。

1.1.2 試劑

甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙縮醛、甲醇、丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、乙酸丁酯、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、己酸乙酯、正戊醇、庚酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、β-苯乙醇、乳酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯、十六酸乙酯、乙酸正戊酯、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、2-乙基丁酸標準品（均為色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

安捷倫7890A氣相色譜儀（配有DB-WAX毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID））：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標準溶液配制

內標溶液配制：分別吸取200 μL乙酸正戊酯，200 μL 2-乙基丁酸，用體積分數(shù)60%的乙醇溶液定容至10 mL。

混合標準溶液配制：分別吸取甲酸乙酯、乙縮醛、甲醇、丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、乙酸丁酯、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、正丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、正戊醇、庚酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯、乙酸、丙酸、壬酸乙酯、丁酸、癸酸乙酯、異戊酸、戊酸、己酸、β-苯乙醇、庚酸、辛酸、十六酸乙酯40 μL，分別吸取乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯200 μL，用體積分數(shù)60%的乙醇定容至10 mL作為母液。分別吸取母液5 mL、1 mL、200 μL、80 μL，用體積比為60%乙醇定容至10 mL，加入內標溶液0.1 mL，為標準溶液。

1.3.2 色譜條件

起始溫度為40℃維持10min，3℃/min升至70℃，4 ℃/min升至180 ℃，15 ℃/min升至210 ℃，維持5 min。進樣口溫度200.0 ℃；隔墊吹掃流量30 mL/min。分流比20∶1。檢測器溫度230.0 ℃；空氣流量400 mL/min，氫氣流量3 mL/min。流動相為氮氣，流速1 mL/min。

1.3.3 工作曲線的制作及檢出限的測定

不同濃度混標由低濃度到高濃度依次進樣分析，繪制標準工作曲線。以信噪比（S/N）=3，計算檢出限（limitofdetection，LOD）。

1.3.4 精密度試驗

測定NX7酒樣中不同物質的含量，平行測定3次，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5 加標回收試驗

采用標準品加入法對NX7酒樣做3個水平加標回收試驗（各做3次平行），測定回收率。

1.3.6 白酒樣品測定

白酒樣品過0.45μm水相濾膜，定容到10 mL，加入0.1 mL內標溶液，采用氣相色譜測定白酒成分。進樣量：1 μL。每個樣品平行測定3次。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

以白酒樣品為醬香型白酒賦值為0，為濃香型賦值為1，為清香型賦值為2，設定為因變量[16]。以香氣成分的含量設定為自變量。選取樣本的16%為驗證集，84%為訓練集，先將訓練集導入SIMCAP-14.1軟件中進行PLS分析。

2 結果與分析

2.1 混合標準溶液色譜圖

圖1 32種香氣成分混合標準溶液氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of 32 kinds of mixed standards of aroma substance

由圖1可知，除3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇的分離度為0.9，其余相鄰兩種物質的分離度均大于1.5。因此，標準品色譜圖中32種標準品與2種內標的分離效果較好，滿足實驗要求。

2.2 定量關系及檢出限

以信噪比為3為檢測限濃度，以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，建立線性方程。相關系數(shù)R2、檢出限各組分的相關系數(shù)R2在0.999 01～0.999 99，R2均＞0.999，檢出限范圍分別為0.17～7.50 mg/L。說明在一定濃度范圍內，32種香氣成分的線性關系良好。

2.3 精密度

采用氣相色譜對某濃香型白酒的香氣成分進行定量，實驗結果見表1。結果表明，各成分測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）＜6%，表明該方法精密度較高，該方法能夠滿足白酒中香氣成分的定量要求。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision tests

2.4 加標回收試驗

香氣物質加標回收率試驗結果見表2。結果表明，NX7酒樣中香味物質加標回收率結果的RSD在0.18%～3.63%，表明具有良好的重復性，回收率也均在80.20%～97.93%。可見該方法回收率高，可用于檢測白酒中香味物質的含量。

表2 香氣物質加標回收率試驗結果Table 2 Results of recovery rates of aroma compounds

續(xù)表

續(xù)表

2.5 樣品香氣成分測定

濃香型白酒中己酸乙酯的含量在813.19～1370.53mg/L，乙酸乙酯的含量在596.00～955.46 mg/L，乳酸乙酯的含量在316.55～792.97 mg/L。醬香型白酒中己酸乙酯19.38～87.47mg/L，乙酸乙酯1.19～2641.87mg/mL，乳酸乙酯624.46～1 798.68 mg/L。清香型白酒中己酸乙酯0～3.54 mg/L，乙酸乙酯在340.46～1389.06mg/L，乳酸乙酯198.67～983.61mg/L。

濃香型白酒中酸類物質含量僅次于酯類，其中乙酸350～561.92 mg/L，己酸388.07～554.15 mg/L和丁酸24.17～140.28 mg/mL具有較高的濃度水平。醬香型白酒中乙酸443.01～1 730.89 mg/mL，己酸10.61～48.82 mg/mL，丁酸23.51～96.26 mg/mL。在清香型白酒中乙酸247.39～699.57 mg/mL，己酸4.18～16.17 mg/mL。

高級醇一般由發(fā)酵過程中氨基酸的降解和葡萄糖經糖酵解途徑的轉化而生成[19]。濃香型白酒含量較高有正丙醇（2.28～170.25mg/L）和3-甲基-1-丁醇（2.37～190.22mg/L）。醬香型白酒有正丙醇（178.16～1 428.39 mg/L），3-甲基-1-丁醇（22.33～316.39 mg/L）。清香型白酒中有正丙醇（58.84～167.13 mg/mL），3-甲基-1-丁醇（0～286.10 mg/L）。

2.6 模型判別分析

2.6.1 PLS分析

采用Simac-p14.1軟件中內置的留一法（leave-one-out）對樣本進行PLS 分析。PLS模型提取3個主成分t1、t2和t3。主成分t1自變量特征值貢獻度為29.5%，因變量特征值貢獻度為66.7%；主成分t2自變量特征值貢獻度為12.3%，因變量特征值貢獻度為20.7%；主成分t3自變量特征值貢獻度為17.1%，因變量特征值貢獻度為5.83%。前3個主成分自變量特征值貢獻度為59.0%，對因變量特征值貢獻度為93.3%，而3個主成分所預測模型的累計差異為89.9%。這說明該模型的預測精度和效度不錯。

訓練集所建立的模型中，以第一主成分t1的得分值為橫坐標和第二主成分t2的得分值為縱坐標繪制得分散點圖2。由圖2可知，不同香型的白酒彼此分開，其中香型相同白酒較集中。所有樣本都落在95%的置信區(qū)間內，無異常值。

圖2 訓練集得分圖Fig.2 Score plot of the training set

2.6.2 模型驗證

采用樣本數(shù)據(jù)的隨機排列進行統(tǒng)計推斷PLS模型是否存在過擬合的情況[20]。Y的順序被隨機地重復50次。比較訓練集模型的擬合優(yōu)度R2與預測優(yōu)度Q2。從圖3可以看出，擬合優(yōu)度都大于預測優(yōu)度，且擬合優(yōu)度的趨勢線在縱軸上的截距為0.201，預測優(yōu)度的趨勢線在縱軸上的截距為-0.399。一般認為擬合優(yōu)度的趨勢線在縱軸上的截距＜0.4，預測優(yōu)度的趨勢線在縱軸上的截距＜0.05，則模型不存在過擬合的情況。

圖3 不同白酒香型樣品排列檢驗Fig.3 Permutations plot for the different flavor Baijiu

以訓練集真實值為縱坐標、估計值為橫坐標，繪制散點圖4。由圖4可知，且兩者之間的差異由評估均方差（root mean square error of estimation，RMSEE）表示。顯示了PLS模型中作為訓練集的不同真實值與估計值之間的關系。RMSEE的值為0.217 623，且可以看出不同香型白酒能明顯分開。由于預測均方差（root mean square error of prediction，RMSEP）值與RMSEE值相差不大，說明模型的效果好。為了驗證PLS訓練集模型，將不同香型白酒的驗證集帶入訓練集所創(chuàng)建的模型中進行驗證。預測不同白酒的香型，模型能力由驗證集產生的RMSEP表示。PLS模型中作為驗證集的不同香型白酒的真實值與估計值之間的關系見圖5。由圖5可知，RMSEP 的值為0.245 351，且不同香型白酒被預測出來。

圖4 偏最小二乘法分析中訓練集中的真實值與估計值的關系Fig.4 Relationship between true value and estimate value of partial least square derived training set

圖5 偏最小二乘法分析中驗證集中的真實值與估計值的關系Fig.5 Relationship between true value and estimate value of partial least square derived validation set

3 結論

為建立一種白酒香型判斷方法，采用氣相色譜分析白酒香氣成分。結果表明該方法香氣成分線性相關系數(shù)R2＞0.999，檢測限＜5.11 mg/L，精密度試驗結果RSD＜4.11%；平均回收率為80.20%～97.93%。采用PLS對不同香型白酒香氣成分分析，建立了預測模型，由排列檢驗結果說明模型不存在過擬合現(xiàn)象，通過比較預測值與真實值表明PLS模型具有較好地預測能力，由參數(shù)RMSEE和RMSEP值能證明預測精度較高，能夠較好的判斷出白酒香型。本研究為白酒香型判別提供一條新的途徑和思路。