酸和鹽脅迫對乳酸菌活性的影響

呂嘉櫪，伍金金，周冰洋，羅 瀟

（陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

乳酸菌能夠增強(qiáng)人體免疫力、修復(fù)腸粘膜損傷、抗氧化、抑菌、降血脂、降膽固醇、治療乳腺炎等[1-7]，廣泛應(yīng)用于食品與發(fā)酵工業(yè)[8-10]，乳酸菌的活性是影響其產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用的重要因素。研究表明，影響乳酸菌活性的因素有很多，如溫度、pH、鹽濃度、氧濃度、營養(yǎng)物質(zhì)等[11-14]。

發(fā)酵食品的顯著特征是高含鹽量，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行積累大量的酸，所以研究酸和鹽脅迫對乳酸菌活性的影響十分重要。王璐[15]對嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）進(jìn)行耐鹽實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對這兩株乳酸菌的生長有很大的抑制作用，接著不斷地將乳酸菌轉(zhuǎn)接到更高鹽濃度的培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)馴化后的乳酸菌能夠提高對鹽脅迫的耐受性；南曉芳等[16]從豆豉和腐乳中分離并篩選出了5株耐鹽性高達(dá)12%的乳酸菌，乳酸菌的耐鹽特性對于提高豆豉和腐乳的品質(zhì)有著重要的作用；崔樹茂[17]研究了不同濃度的氯化鈉、乳酸鈉和乙酸鈉對乳酸菌生長的影響，結(jié)果表明這3種胞外酸根對乳酸菌完全抑制時(shí)的濃度相同；施為家[18]研究發(fā)現(xiàn)，pH值對乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、胞內(nèi)酶的活性和有氧呼吸效率等許多細(xì)胞生理功能都有十分重要的影響；閆征等[19]分別用乳酸和HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)初始pH值，研究了不同pH條件下乳酸產(chǎn)量和乳酸菌的生長情況，結(jié)果表明，乳酸的逐漸積累是導(dǎo)致乳酸菌的生長和乳酸產(chǎn)量受到抑制的直接原因，而H+濃度的增加（pH降低）則是間接原因；尚天翠[20]和熊素玉等[21]分別從乳制品中分離純化出10株和24株乳酸菌，研究發(fā)現(xiàn)這兩次分離純化的乳酸菌最適pH值都在6.5左右。目前對于酸和鹽脅迫條件下乳酸菌活性的影響已有一些報(bào)道，但同時(shí)研究酸脅迫和鹽脅迫對乳酸菌活性的影響報(bào)道較少，且大多數(shù)研究選取的乳酸菌菌種不夠全面，不能進(jìn)行橫向比較。

本研究廣泛選取13株食品中常見的乳酸菌，在不同的鹽濃度和pH值條件下培養(yǎng)，測定其在不同鹽和酸條件下的生長曲線，期望獲得每株菌最適的酸和鹽生長條件，并進(jìn)行橫向比較，并探索這13株乳酸菌的耐酸、耐鹽能力，為乳酸菌更好地應(yīng)用于食品行業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試乳酸菌

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）（Lb）、嗜酸乳桿菌（Lactibacillus acidophilus）（La）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）（Lc）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（Lp）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）（Lr）、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）（Bl）、動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）（Ba）、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）（Bi）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）（Lcp）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）（Pi）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（Pp）、乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.）（Ll）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（St）：均由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基[22]：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母膏4 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二氨2 g，吐溫-80 1 mL，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.04 g，MnSO4·7H2O 0.2 g，水1 000 mL。pH值自然，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二氨、吐溫-80、K2HPO4、MnSO4·4H2O、MnSO4·7H2O、甲苯胺藍(lán)、氫氧化鈉、濃鹽酸、醋酸、氯化鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；DHP-9080電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海佳勝試驗(yàn)設(shè)備有限公司；101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌種的活化

將MRS液體培養(yǎng)基加入?yún)捬豕苤校瑥墓腆w斜面培養(yǎng)基將供試乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃活化培養(yǎng)48 h，甲苯胺藍(lán)染色[23]，鏡檢，無雜菌后二次活化，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹24]。

1.3.2 乳酸菌生長曲線的測定

將活化好的乳酸菌分別以1%（V/V）的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，分別在培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取樣，以未接種的MRS液體調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在波長為600 nm處測定樣品的OD600nm值。以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制乳酸菌的生長曲線。

1.3.3 鹽脅迫對乳酸菌生長的影響

MRS液體培養(yǎng)基中分別添加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的NaCl，將活化好的乳酸菌分別以1%（V/V）的接種量接種到不同鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，分別在培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h時(shí)取樣，以未接種的MRS液體調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在波長600 nm處測定樣品的OD600nm值，繪制乳酸菌的生長曲線。

1.3.4 酸脅迫對乳酸菌生長的影響

用1 mol/L HCl溶液將MRS液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，再用1 mol/L NaOH溶液將MRS液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)為7.0。取活化好的乳酸菌分別以1%（V/V）的接種量接種于不同pH值的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)168 h，分別在培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h時(shí)取樣，以未接種的MRS液體調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在波長600 nm處測定樣品的OD600nm值，繪制乳酸菌的生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的生長曲線

圖1 13株乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria

由圖1可知，13株乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中生長良好，其中乳酸菌Pi和Pp遲緩期為4 h，乳酸菌Lp、Lc、Lcp遲緩期為8 h，乳酸菌Lr、Ll和St遲緩期為12 h，乳酸菌Lb、La、Bl、Bi和Ba遲緩期為20 h，進(jìn)入對數(shù)期后，13株乳酸菌的活菌數(shù)均直線上升，36 h后所有乳酸菌到達(dá)穩(wěn)定期，并且在穩(wěn)定期，OD600nm值一直保持較高水平，72 h內(nèi)沒有進(jìn)入衰亡期。到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)乳酸菌Lb和La的OD600nm值低于另外11株菌，說明自然狀態(tài)下乳酸菌Lb和La活性低于其他11株菌。

2.2 鹽脅迫對13株乳酸菌生長的影響

圖2 1%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 1%

由圖2可知，鹽濃度為1%時(shí)，乳酸菌Lp和Lcp的遲緩期為4 h，乳酸菌Lc、Pp和Pi的遲緩期為8 h，乳酸菌Lb、Ll、St、La和Lr的遲緩期為12 h，乳酸菌Bi、Bl和Ba的遲緩期為20 h，乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的遲緩期比不加鹽時(shí)的短，且到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的OD600nm值高于不加鹽時(shí)穩(wěn)定期的OD600nm值，表明鹽濃度為1%時(shí)有利于乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的生長。

圖3 2%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 2%

由圖3可知，鹽濃度為2%時(shí)，乳酸菌Lcp和Lp的遲緩期為4 h，乳酸菌Lr、Pi、Pp和Lc的遲緩期為8 h，乳酸菌St和Ll遲緩期為12 h，乳酸菌Ba和La的遲緩期為16 h，乳酸菌Bl和Lb的遲緩期為20 h，乳酸菌Bi的遲緩期為24 h，說明鹽濃度為2%有利于縮短乳酸菌Lp、Lcp、Lr、La、Ba的生長遲緩期，促進(jìn)這5株菌的前期生長；到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)乳酸菌Lc的OD600nm值低于其他12株菌，說明鹽濃度為2%時(shí)乳酸菌Lc對鹽脅迫更敏感；乳酸菌Lb及La的穩(wěn)定期OD600nm值同樣高于不加鹽時(shí)的穩(wěn)定期OD600nm值，且高于鹽濃度為1%時(shí)的穩(wěn)定期OD600nm值，說明鹽濃度為2%進(jìn)一步促進(jìn)了乳酸菌Lb、La的生長。

圖4 3%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.4 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 3%

由圖4可知，鹽濃度為3%時(shí)增加了乳酸菌Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Ba、Lb的生長遲緩期，抑制了這8株菌的前期生長；到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)除了乳酸菌Lb和La，其余11株乳酸菌的生長都受到了抑制，且乳酸菌Lc和Pi的穩(wěn)定期OD600nm值低于其他11株菌，說明鹽濃度為3%時(shí)乳酸菌Lc和Pi對鹽脅迫更敏感。

圖5 4%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.5 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 4%

由圖5可知，鹽濃度為4%時(shí)增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ll、St的生長遲緩期，抑制了這10株菌的前期生長；到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)除了乳酸菌Lb和La，其余11株乳酸菌的生長都受到了抑制，乳酸菌Pi和Ll的OD600nm值較其他11株菌低，且乳酸菌Pi最早進(jìn)入衰亡期，說明鹽濃度為4%時(shí)乳酸菌Pi和Ll對鹽脅迫更敏感。

由圖6可知，鹽濃度為5%時(shí)增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ba、Ll、St的生長遲緩期，抑制了這11株菌的前期生長；到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)除了乳酸菌La，其余12株乳酸菌的OD600nm值都低于不加鹽時(shí)的OD600nm值，說明鹽濃度為5%抑制了這12株乳酸菌的生長。

由圖7可知，鹽濃度為6%時(shí)增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ba、Ll、St的生長遲緩期，抑制了這11株菌的前期生長；到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)除了乳酸菌La，其余12株乳酸菌的生長都受到了抑制，Lcp、Pi和Ll的OD600nm值較其他乳酸菌低，說明鹽濃度為6%時(shí)乳酸菌Lcp、Pi和Ll對鹽脅迫更敏感。

圖6 5%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.6 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 5%

圖7 6%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.7 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 6%

圖8 7%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.8 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 7%

由圖8可知，除了乳酸菌Lcp，其余12株菌的遲緩期都顯著增加，鹽濃度為7%抑制了這12株菌的前期生長；到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)13株乳酸菌的OD600nm值都低于不加鹽時(shí)的OD600nm值，說明鹽濃度為7%抑制了這13株乳酸菌的生長。

由圖9可知，鹽濃度為8%對這13株乳酸菌的整個(gè)生長過程都有抑制作用，且對乳酸菌Lcp、Lp、Pi、Pp、Lr、Ll、St的生長抑制率＞50%，對乳酸菌La、Bi、Bl、Ba、Lb、Lc的生長抑制率＞95%。

由圖10可知，鹽濃度為9%對這13株乳酸菌的生長有顯著抑制作用，且對乳酸菌Lcp、Pi、St、Pp、Ll的生長抑制率＞70%，對其余8株乳酸菌的生長抑制率＞95%。

圖9 8%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.9 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 8%

圖10 9%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.10 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 9%

圖11 10%鹽濃度時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.11 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 10%

由圖11可知，鹽濃度為10%時(shí)，乳酸菌Lcp在第8小時(shí)開始緩慢生長，在第36小時(shí)時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，最終穩(wěn)定期OD600nm值為0.165，中間沒有出現(xiàn)明顯的對數(shù)生長期，OD600nm值維持在0.1左右；乳酸菌Pi、Pp、St及Ll在48 h后開始生長，72 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，最大OD600nm值為1.053；其余8株菌直至測定結(jié)束OD600nm值沒有顯著變化，接近于零。說明鹽濃度為10%對這13株乳酸菌的生長有顯著抑制作用，且除了乳酸菌Pi、Pp、St、Ll，其余9株乳酸菌的生長抑制率都＞95%，高鹽濃度對9株桿菌的抑制作用強(qiáng)于4株球菌。

2.3 酸脅迫對13株乳酸菌生長的影響

圖12 pH=1時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.12 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=1

圖13 pH=2時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.13 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=2

圖14 pH=3時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.14 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=3

由圖12～14可知，pH=1～3時(shí)，13株乳酸菌都不能明顯的生長，OD600nm值一直維持在較低水平，最大不超過0.3，其中4株球菌的OD600nm值高于9株桿菌，說明高酸條件對9株桿菌的抑制作用強(qiáng)于4株球菌；12～24 h是9株桿菌的對數(shù)生長期，24 h后OD600nm值基本維持在0.1左右。原因是培養(yǎng)基中所加乳酸的量過多，抑制了乳酸菌本身發(fā)酵產(chǎn)乳酸的過程，另一方面，pH值過低本身就不利于乳酸菌繼續(xù)生長。

由圖15可知，pH=4時(shí)，長勢較好的前3株菌依次是乳酸菌Lcp、Lr、Pi，其中，乳酸菌Lcp的遲緩期為12 h，最終穩(wěn)定期OD600nm值為2.510，乳酸菌Lr在第48小時(shí)進(jìn)入對數(shù)期生長，最終穩(wěn)定期OD600nm值為2.256，乳酸菌Pi也在第48小時(shí)進(jìn)入對數(shù)生長期，最終穩(wěn)定期OD600nm值為1.983，這3株菌直到測定結(jié)束的168 h內(nèi)并未出現(xiàn)衰亡期，說明這3株乳酸菌在酸脅迫開始解除時(shí)最先生長。乳酸菌Lb和La在96 h后顯著生長，最大OD600nm值為1.192，說明pH=4對乳酸菌Lb和La的前期生長仍有抑制作用，直到適應(yīng)pH條件后活菌數(shù)開始上升，但仍未達(dá)到自然條件下的活菌數(shù)。其余8株菌遲緩期為24 h，此后緩慢生長，在144 h后都進(jìn)入了穩(wěn)定期，且最終穩(wěn)定期OD600nm值都比較低，說明pH=4對這8株乳酸菌的生長仍有抑制作用。

圖15 pH=4時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.15 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=4

圖16 pH=5時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.16 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=5

由圖16可知，pH=5時(shí)，乳酸菌Pi和Pp的遲緩期為8 h，乳酸菌Lc、Lp、Lcp和Lr的遲緩期為12 h，乳酸菌La的遲緩期為36 h，其余6株菌的遲緩期為24 h，13株乳酸菌在48 h后都進(jìn)入了穩(wěn)定期，且穩(wěn)定期OD600nm值都維持在較高水平，說明13株乳酸菌在測定結(jié)束時(shí)都長勢良好。

由圖17可知，pH=6時(shí)，乳酸菌Lcp、Pi和Pp的遲緩期為4 h，其余10株菌的遲緩期分別在8 h、12 h和24 h，之后進(jìn)入對數(shù)期，OD600nm值顯著增大，在36 h后都進(jìn)入了穩(wěn)定期且穩(wěn)定期OD600nm值都維持在較高水平，說明pH=6時(shí)13株乳酸菌都長勢良好；乳酸菌Lb、La、Lc、Lr、Lp、Bl、Bi、Ba、Lcp、Pp、St的最終穩(wěn)定期OD600nm值都高于pH=5時(shí)的最終穩(wěn)定期OD600nm值，說明pH=6時(shí)這11株乳酸菌的活性高于pH=5。

圖17 pH=6時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.17 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=6

圖18 pH=7時(shí)13株乳酸菌的生長曲線Fig.18 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=7

由圖18可知，pH=7時(shí)，乳酸菌Lr、Lp、Lc及Lcp在24 h時(shí)已進(jìn)入穩(wěn)定期，乳酸菌Pi、St、Ll和Pp在36 h時(shí)基本進(jìn)入穩(wěn)定期，其余5株乳酸菌在48 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，13株乳酸菌的穩(wěn)定期OD600nm值都維持在較高水平，說明培養(yǎng)期間13株乳酸菌的長勢良好；乳酸菌Lb、La、Lc、Lr、Lcp、Pi、Li、Pp、St的最終穩(wěn)定期OD600nm值都低于pH=6時(shí)的最終穩(wěn)定期OD600nm值，說明pH=7時(shí)這9株乳酸菌的活性低于pH=6。

3 結(jié)論

適當(dāng)?shù)牡望}濃度（1%、2%）對部分乳酸菌的生長有促進(jìn)作用，植物乳桿菌和副干酪乳桿菌的最適鹽濃度為1%，保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適鹽濃度為2%；鹽濃度進(jìn)一步增大，13株乳酸菌的生長受到抑制；鹽濃度為10%時(shí)，13株乳酸菌的生長受到明顯的抑制作用，除了戊糖片球菌、乳酸片球菌、嗜熱鏈球菌及乳酸乳球菌乳酸亞種，其余9株乳酸菌的生長抑制率都＞95%。當(dāng)pH值為5～7時(shí)，13株乳酸菌均生長良好；當(dāng)pH=6時(shí)，7株乳酸菌活性最高；隨著酸脅迫的增強(qiáng)，13株乳酸菌生長受抑制程度增大；當(dāng)pH值為1～3時(shí)，13株乳酸菌的生長抑制率都＞90%。隨著酸和鹽脅迫作用增強(qiáng)，乳酸菌生長的抑制程度逐漸增大，且高鹽、高酸條件對9株桿菌的抑制作用強(qiáng)于4株球菌。通過研究酸和鹽脅迫對乳酸菌活性的影響，為進(jìn)一步開發(fā)利用乳酸菌資源提供一定的科學(xué)依據(jù)。