一株紫色紅曲霉菌強(qiáng)化制曲的工藝優(yōu)化

程 偉，張 杰，潘天全，李 娜，吳 龍，時(shí)玉英，吳麗華，吳宏萍

（1.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽 阜陽(yáng) 236023；2.安徽金種子集團(tuán)有限公司檢測(cè)中心，安徽 阜陽(yáng) 236018）

紅曲霉作為傳統(tǒng)食品加工的特殊微生物，主要用于生產(chǎn)紅曲[1]。紅曲是以大米為主要原料，經(jīng)紅曲霉固態(tài)發(fā)酵而制成的一種米曲，紅曲米含有抗氧化和抗腫瘤等活性成分[2]。紅曲霉耐高溫，生長(zhǎng)溫度范圍在15～45 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，最適生長(zhǎng)pH值為3.5～5，耐pH最低為2.5，嗜乳酸，耐乙醇濃度為10%vol[3]。多數(shù)紅曲霉能代謝產(chǎn)生紅曲色素，產(chǎn)生的色素進(jìn)入培養(yǎng)基中，進(jìn)而使培養(yǎng)基的背面呈現(xiàn)出不同的顏色[4]。紅曲霉生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生多種酶類(lèi)（如淀粉酶、糖化酶、酯化酶等），用于制備紅曲米醋或紅曲麩曲；有些菌株還能代謝產(chǎn)生較高活性的蛋白酶，用于腌制“色、香、味”俱佳的紅曲腌漬魚(yú)、肉或豆腐等高蛋白食品[5-6]。

白酒釀造中的酯化菌主要包括霉菌和酵母菌等，其主要來(lái)源于釀酒大曲，市售的商品酯化紅曲復(fù)合酯化酶生態(tài)菌劑主要用于提高原酒的出酒率和優(yōu)質(zhì)率等，生產(chǎn)應(yīng)用效果明顯[7-8]。

為研究分離篩選自企業(yè)的紅曲霉菌株的制曲生產(chǎn)特性，優(yōu)化該菌株酯化紅曲的制備工藝，以制備適合白酒釀造的酯化紅曲，本研究通過(guò)對(duì)紅曲霉菌株ZHX9進(jìn)行液體培養(yǎng)，再分別以大米、麩皮及混合料等為原料進(jìn)行純種培養(yǎng)，選取種子液添加量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和曲料含水率等作為影響因素，以強(qiáng)化制曲的酯化力為考察指標(biāo)，優(yōu)化酯化紅曲的制備工藝，該研究可為紅曲霉菌株ZHX9的制曲生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

制曲原料（麩皮、大米、稻殼等）：金種子酒業(yè)制曲車(chē)間；紅曲霉（Monascus purpureus）ZHX9：金種子酒業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室；葡萄糖、NaNO3、MgSO4·7H2O、乳酸等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖70 g，牛肉膏15 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH自然。斜面培養(yǎng)基：種子液培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g。米曲培養(yǎng)基：大米浸泡1～2 h后瀝水，常壓蒸40～60 min左右至米飯蒸透而不粘手，攤晾冷卻至35 ℃左右。麩曲培養(yǎng)基：麩皮添加適量的清水，并翻拌均勻后瀝干無(wú)明水，含水率在50%左右，0.1 MPa蒸40～60 min左右，攤晾冷卻至35 ℃左右。混合料培養(yǎng)基：麩皮∶米粉∶干燥曲酒糟（96∶3∶1，g∶g）添加適量的清水，翻拌均勻后瀝干無(wú)明水，含水率在50%左右，0.1 MPa蒸40～60 min左右，攤晾冷卻至35 ℃左右。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-100VD立式壓力蒸汽滅菌器、BJ-2CD凈化工作臺(tái)：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HYG-W1恒溫?fù)u床：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；LHS-800HC-II恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；7890B氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；麩曲培曲框：本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅曲霉菌株的的活化及其種子液培養(yǎng)

將紅曲霉菌株ZHX9轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d活化，取0.5 cm2左右的菌塊接種到種子液培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3～5 d，菌絲球生長(zhǎng)均勻濃密，可在種子培養(yǎng)基中添加數(shù)顆玻璃珠以防止菌絲球過(guò)于集中生長(zhǎng)。

1.3.2 強(qiáng)化制曲

攤晾冷卻后的米飯噴灑乳酸稀釋液，并接種10%左右的種子液，翻拌均勻后置于培養(yǎng)框內(nèi)；培養(yǎng)框的下層及米料的表層均鋪設(shè)有2層已滅菌的醫(yī)用紗布，米料厚度在5～10 cm，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培曲，培養(yǎng)箱濕度100%，30 ℃間歇通風(fēng)培養(yǎng)。以成品米曲的酯化力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)置單因素試驗(yàn)考察培養(yǎng)時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、培養(yǎng)溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、曲料水分含量（35%、45%、50%、65%、70%）、不同乳酸含量（0、2‰、4‰、6‰、8‰）等條件對(duì)強(qiáng)化米曲培養(yǎng)的影響。

1.3.3 菌株ZHX9的強(qiáng)化曲酶活檢測(cè)

強(qiáng)化曲的糖化力、發(fā)酵力等的測(cè)定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中的方法并略有調(diào)整[9]。酯化力的測(cè)定，稱(chēng)取相當(dāng)于5 g干曲的曲量，加入100 mL含1%己酸、20%vol乙醇的酯化體系中，32 ℃酯化100 h，加水50 mL蒸餾，接餾出液100 mL，用氣相色譜檢測(cè)反應(yīng)體系中形成的己酸乙酯含量。酯化力定義：100 mL餾出液中含己酸乙酯的毫克數(shù)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZHX9的活化及其種子液培養(yǎng)

產(chǎn)酯化酶微生物液態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)生的酯化酶具有催化發(fā)酵體系中有機(jī)酸酯的合成等作用，酯化酶催化反應(yīng)既能利用發(fā)酵物料成分進(jìn)行生化反應(yīng)進(jìn)而合成有機(jī)酸酯，當(dāng)合成的有機(jī)酸酯達(dá)到一定濃度時(shí)，酯化酶又能分解產(chǎn)生的有機(jī)酸酯；隨著發(fā)酵體系反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，發(fā)酵體系中剩余酯最多的時(shí)間點(diǎn)或酯化達(dá)到平衡的時(shí)間即為該產(chǎn)酯化酶微生物發(fā)酵的最佳培養(yǎng)時(shí)間[11]。紅曲霉液態(tài)發(fā)酵可產(chǎn)生包括紅曲色素、酯化酶等在內(nèi)的多種酶類(lèi)，以及具有降血脂功效的紅曲Monacolin K等特殊活性物質(zhì)[12]，對(duì)液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化研究有利于實(shí)現(xiàn)紅曲及其酶類(lèi)制品的工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)[13-16]。由圖1可知，活化后的保藏菌株ZHX9狀態(tài)良好，菌絲初為粉紅色，后顏色逐漸加深呈紫紅色，其菌落生長(zhǎng)致密、可見(jiàn)氣生菌絲、培養(yǎng)基呈深紫紅色；斜面培養(yǎng)基的背面可見(jiàn)有明顯的菌落褶皺；成熟種子液的菌絲球與菌絲體呈混合狀態(tài)且生長(zhǎng)濃密，種子液呈淡黃色，稍黏稠，氣味正常，稍有醇香。

圖1 紅曲霉菌株ZHX9的斜面保藏及其成熟種子液的培養(yǎng)特征Fig.1 Slope preservation of Monascus strain ZHX9 and culture characteristics of its mature seed solution

2.2 菌株ZHX9的米曲培養(yǎng)

由于大米等多孔基質(zhì)的疏松程度不同，影響了空氣等物質(zhì)的傳遞，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)微環(huán)境的差異，因此，固態(tài)發(fā)酵具有典型的不均一性；其中，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、曲料水分含量等對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲米曲的培養(yǎng)質(zhì)量具有重要影響[17]。

由圖2（a）可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，固態(tài)發(fā)酵強(qiáng)化米曲的酯化力不斷增加；其中，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到3 d時(shí)，強(qiáng)化米曲的酯化力達(dá)到715 mg/100 mL，培養(yǎng)5 d時(shí)強(qiáng)化米曲的酯化力變化不明顯，因此，確定強(qiáng)化米曲的培養(yǎng)時(shí)間為3 d較為適宜。由圖2（b）可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，固態(tài)發(fā)酵強(qiáng)化米曲的酯化力呈先升高后降低的趨勢(shì)，培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)酯化力最高，之后略有下降。因此確定強(qiáng)化米曲的培養(yǎng)溫度為35 ℃較為適宜。曲料水分含量低會(huì)影響制曲微生物的生長(zhǎng)，水分含量高時(shí)曲料容易結(jié)團(tuán)且通氣性差，同樣不利于制曲微生物的生長(zhǎng)，對(duì)成品麩曲及麩曲發(fā)酵產(chǎn)酒的酸度有不利影響，由圖2（c）可知，曲料水分含量在55%左右較為合適。與細(xì)菌和放線菌相比，多數(shù)霉菌更易在酸性環(huán)境下生長(zhǎng)，曲料具有一定的酸度還有利于培曲前期雜菌的控制；由于紅曲霉具有耐乳酸的特性，因此，通過(guò)添加乳酸來(lái)調(diào)節(jié)曲料培養(yǎng)基的pH值，由圖2（d）可知，不同乳酸濃度對(duì)紅曲霉菌固態(tài)發(fā)酵合成酯化酶具有顯著的影響，在乳酸濃度為4‰時(shí)較為合適。綜合可知，紅曲霉菌株ZHX9的強(qiáng)化米曲較適宜的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)時(shí)間為3 d，培養(yǎng)溫度為35 ℃，水分含量為55%，乳酸添加濃度為4‰。

圖2 菌株ZHX9強(qiáng)化米曲培養(yǎng)的主要影響因素考察Fig.2 Main influencing factors on culture of strain ZHX9 cultured by intensified Miqu

菌株ZHX9的強(qiáng)化米曲培養(yǎng)過(guò)程中的感官變化見(jiàn)圖3。由圖3可知，大米蒸煮后攤晾降溫到35 ℃左右，種子液的接種量為10%左右，噴灑4‰的乳酸并翻拌均勻；溫度35 ℃，濕度100%，間歇通風(fēng)培養(yǎng)24 h，菌絲萌發(fā)，呈現(xiàn)乳白色，有的米粒呈現(xiàn)淡紅色；再培養(yǎng)48 h，菌絲生長(zhǎng)旺盛、菌絲飽滿(mǎn)并深入到米粒內(nèi)部，呈現(xiàn)淡紅色，以后逐漸加深，由淡紅色為深紅色，最后成為紫紅色，局部有橙紅色或黃色；培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察米料的品溫及干濕情況，及時(shí)噴灑無(wú)菌水或翻拌米料，翻拌米料時(shí)可以聞到有酒香氣味。培養(yǎng)3 d的成熟米曲，置于40 ℃通風(fēng)干燥粉碎后得到的固體曲粉呈深紫紅色。

圖3 紅曲霉菌株ZHX9的強(qiáng)化米曲培養(yǎng)特征Fig.3 Characteristics of intensified Miqu culture of Monascus strain ZHX9

2.3 菌株ZHX9的麩曲培養(yǎng)

麩曲是以麩皮為原料，經(jīng)蒸煮滅菌、冷卻等，接入純種釀酒微生物，在人工控制條件下經(jīng)培養(yǎng)、低溫烘干而制備的散曲，主要有細(xì)菌麩曲、根霉麩曲和酵母麩曲等類(lèi)型[18]。

曲料的含水量是制備麩曲過(guò)程中的重要因素，含水量過(guò)低，曲料過(guò)快干結(jié)，達(dá)不到制曲微生物生長(zhǎng)需求的濕潤(rùn)環(huán)境；含水量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致曲料結(jié)合緊密，曲料的供氧和散熱都受到影響，導(dǎo)致曲料溫度控制困難，從而影響制曲微生物的代謝產(chǎn)酶，由此可見(jiàn)，曲料的含水量對(duì)純種麩曲質(zhì)量的影響較為明顯[19]。

菌株ZHX9的強(qiáng)化麩曲培養(yǎng)過(guò)程中的感官變化見(jiàn)圖4。由圖4可知，麩皮蒸煮后攤晾降溫到35 ℃左右，種子液的接種量為10%左右，噴灑4‰的乳酸并翻拌均勻，曲料含水量在55%左右；溫度35 ℃，濕度100%，間歇通風(fēng)培養(yǎng)24 h，菌絲萌發(fā)，呈現(xiàn)乳白色；再培養(yǎng)48 h，菌絲生長(zhǎng)旺盛、菌絲飽滿(mǎn)并深入到曲料內(nèi)部，局部呈現(xiàn)淡紅色；培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察曲料的品溫及干濕情況，及時(shí)噴灑無(wú)菌水或翻拌曲料，翻拌曲料時(shí)可以聞到有明顯曲香。若成品麩曲的含水較高則對(duì)麩曲的保存、釀酒發(fā)酵條件的控制及產(chǎn)酒質(zhì)量等產(chǎn)生不利影響；因此，培養(yǎng)成熟的麩曲應(yīng)通風(fēng)干燥，通常干燥溫度不高于40 ℃以保證酶的活力不受影響。烘干后的成品麩曲呈金黃色，局部呈灰褐色，比麩皮顏色略重，具有明顯曲香，無(wú)腐臭等異雜味。

圖4 菌株ZHX9的強(qiáng)化麩曲培養(yǎng)特征Fig.4 Characteristics of intensified Fuqu culture of Monascus strain ZHX9

2.4 菌株ZHX9的混合曲料培養(yǎng)

混合料培養(yǎng)基采用麩皮、米粉、干燥曲酒糟等，其質(zhì)量比為96∶3∶1，添加適量的清水，并翻拌均勻后瀝干無(wú)明水，含水率在50%左右，0.1 MPa帶壓蒸40～60 min左右；再攤晾冷卻至35 ℃左右，添加10%左右的種子液，噴灑4‰的乳酸并翻拌均勻，曲料含水量在55%左右?；旌锨线x用干燥曲酒糟等作為培養(yǎng)基輔料，由于干燥曲酒糟具有彈性，可以起到疏松曲料的作用，培曲過(guò)程中曲料中含有相當(dāng)量的空氣，有利于紅曲霉菌株在有氧的情況下大量繁殖，并避免曲料發(fā)粘以及由于透氣性差所導(dǎo)致的發(fā)酸或發(fā)臭等現(xiàn)象，還有利于降低制曲的生產(chǎn)成本。

如圖5所示，菌株ZHX9的混合曲料培養(yǎng)過(guò)程中，由于干燥曲酒糟的添加增加了曲料的通透性與酸度，有利于紅曲霉菌的生長(zhǎng)，菌株的萌發(fā)時(shí)間提前，且菌體的生長(zhǎng)較快并深入到曲料內(nèi)部，局部呈現(xiàn)紫紅色。干燥后的成品混合料曲呈淺紫紅色，局部呈褐色，具有明顯的曲香，無(wú)腐臭等異雜味。

圖5 紅曲霉菌株ZHX9的混合曲料培養(yǎng)特征Fig.5 Characteristics of enhanced mixed Qu culture of Monascus strain ZHX9

2.5 菌株ZHX9各培養(yǎng)料強(qiáng)化曲的酶活檢測(cè)

由表1可知，利用大米、麩皮或混合曲料制備菌株ZHX9的強(qiáng)化曲，其酯化力、糖化力等指標(biāo)均比傳統(tǒng)釀酒大曲略高，其中米曲酯化力達(dá)到745 mg/100 mL，混料曲糖化力達(dá)到1 065 mg/（g·h），均表明紅曲霉菌株ZHX9具有較高的強(qiáng)化制曲應(yīng)用前景?；旌狭现苽漉セt曲的指標(biāo)與采用大米或麩皮等單獨(dú)作為原料制備的酯化紅曲差距并不明顯，混合料紅曲的糖化力與發(fā)酵力略高，混合料還具有生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)，因此，采用混合料制備酯化紅曲具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

表1 菌株ZHX9的強(qiáng)化曲酶活檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of enzyme activity of intensified Qu of strain ZHX9

有研究表明，酯化紅曲通常采用麩皮、大米等作為生產(chǎn)原料，杜禮泉等[20]應(yīng)用煙灰色紅曲霉制備麩曲，發(fā)現(xiàn)pH對(duì)麩曲的污染控制較為重要，當(dāng)pH控制在4.3～4.8時(shí)可以有效避免麩曲培養(yǎng)過(guò)程中的污染問(wèn)題，酯化率達(dá)到35%以上，采用黃水調(diào)整曲料的酸度明顯優(yōu)于乳酸。李桂英等[8]采用純種紅曲霉制曲，以大米及麩皮制備種子，應(yīng)用大米為主料再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取得較好效果。制曲時(shí)對(duì)原料的處理、培曲過(guò)程中的補(bǔ)水及溫度調(diào)整、通氣控制等都有較高要求。關(guān)于利用大米、麩皮和稻殼等作為混合曲料制備菌株ZHX9的強(qiáng)化紅曲工藝方面，還應(yīng)該針對(duì)配料比例，曲料的pH、含水量及微量成分添加，培曲條件等方面進(jìn)行優(yōu)化分析，以進(jìn)一步提高成品混料酯化紅曲的質(zhì)量。

3 結(jié)論

本研究對(duì)企業(yè)分離篩選的紅曲霉菌ZHX9進(jìn)行液體培養(yǎng)，再分別以大米、麩皮及混合料等為原料進(jìn)行純種培養(yǎng)，其中混合料明顯優(yōu)于大米或麩皮等單獨(dú)作為原料制備酯化紅曲，在培養(yǎng)溫度35 ℃、培養(yǎng)時(shí)間3 d、曲料含水率55%、乳酸添加量4‰條件下，混合料成品酯化紅曲的酯化力為716 mg/100 mL、糖化力為1 065 mg/（g·h）、發(fā)酵力為2.01 g/（0.5 g·72 h），表明該菌株的酯化紅曲具有較高的應(yīng)用價(jià)值。混合料采用麩皮、米粉、稻殼等為原料，各原料的添加比例以及混料曲培養(yǎng)過(guò)程中的條件控制等，還需要進(jìn)一步優(yōu)化分析，以提高成品混料酯化紅曲的質(zhì)量。酯化紅曲傳統(tǒng)固體發(fā)酵中的有關(guān)機(jī)理及其制曲工藝、主要酯化酶的作用特性等還需要進(jìn)一步研究。