刪除嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)支氣管哮喘模型小鼠sPLA2-X的影響*

張翊玲， 曹 穎， 鄭夢(mèng)凝， 姚紅梅， 路 蘋， 葉賢偉

（貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)肺臟免疫性疾病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550002）

支氣管哮喘是呼吸系統(tǒng)的常見病與多發(fā)病，由嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)共同作用導(dǎo)致的氣道慢性炎癥疾病。全球哮喘的發(fā)病率呈進(jìn)行性上升趨勢(shì)，支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，雖然目前對(duì)支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的研究取得了巨大進(jìn)步，但支氣管哮喘有不同亞型和不同表型，因此支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制仍需繼續(xù)深入［1-4］。相關(guān)研究顯示，可溶性磷脂酶A2-X（soluble phospholipase A2-X，sPLA2-X）與支氣管哮喘發(fā)病密切關(guān)聯(lián)。磷脂酶A2可水解催化磷脂生成溶血磷脂和自由脂肪酸，而自由脂肪酸是合成前列腺素（prostaglandin，PG）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的前體，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。肺部富含磷脂酶A2，在支氣管哮喘發(fā)病中，PLA2 通過從膜磷脂中水解釋放花生四烯酸，進(jìn)一步代謝生成前列腺素和白三烯（leukotriene，LT）而釋放大量的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。它將損傷因素、炎癥細(xì)胞、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子和脂類遞質(zhì)等細(xì)胞有形成分和可溶分子物質(zhì)聯(lián)系起來，成為該體系中最重要的活性酶。PLA2 水解膜磷脂釋放的炎癥或過敏性遞質(zhì)，是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要促進(jìn)因素［5-7］。野生型小鼠哮喘模型的肺組織中sPLA2-X 表達(dá)顯著增加。sPLA2-X 與支氣管哮喘呈正相關(guān)，敲除或抑制sPLA2-X后哮喘癥狀改善明顯。然而與磷脂酶A2-X相關(guān)的研究多集中在巨噬細(xì)胞與氣道上皮細(xì)胞，針對(duì)其與嗜酸性粒細(xì)胞是否存在重要關(guān)聯(lián)的相關(guān)研究鮮少，由于嗜酸性粒細(xì)胞在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中扮演非常重要的角色（嗜酸性粒細(xì)胞激活后釋放大量的炎癥介質(zhì)促進(jìn)哮喘發(fā)展［8-10］）。本研究通過嗜酸性粒細(xì)胞刪除后觀察sPLA2-X 的表達(dá)情況，旨在探索sPLA2-X 與嗜酸性粒細(xì)胞的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步明確sPLA2-X 與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系，為哮喘的治療提供新的策略與思路。

材料和方法

1 材料

48 只雌性 6～8 周齡 Balb/c 小鼠，體質(zhì)量約 18～20 g 購買于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房，動(dòng)物證書編號(hào)為SYXK（黔）2018-0001。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）及Al（OH）3凝膠均購自Sigma；測(cè)量血清IgE、白細(xì)胞介素（interleieukin，IL）-4、IL-5、IL-13 含量的 ELISA試劑盒購自BD 及R&D；抗趨化因子受體CCR3 單克隆抗體及同型對(duì)照購買于R&D；測(cè)量sPLA2-X 的ELISA 試劑盒購自Abcam。無創(chuàng)肺功能儀購自BUXCO；超聲霧化器購自Boehringer-Ingelheim。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 SPF 級(jí) 6～8 周雌性 Babl/c 小鼠 48只，分為4 組，每組12 只，分為健康對(duì)照組（Saline/Saline 組）；哮喘對(duì)照組（OVA/Saline 組）；哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組（OVA/anti-CCR3 組）和哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除同型對(duì)照組（OVA/anti-CCR3-isotype組）。

2.2 小鼠支氣管哮喘模型的建立 健康對(duì)照組小鼠于0、7 和14 d 腹腔注射生理鹽水，其余組每只小鼠分別腹腔注射50 μg OVA 與2 mg 氫氧化鋁凝膠（溶于200 μL生理鹽水）。

2.3 嗜酸性粒細(xì)胞刪除抗體的處理 根據(jù)分組于第21 天每只小鼠腹腔注射50 μg anti-CCR3 單克隆抗體或同型對(duì)照（溶于0.15 mL PBS），于第26 天將小鼠進(jìn)行異氟烷吸入麻醉（不宜麻醉過深或過淺），待麻醉合適后，進(jìn)行單鼻孔緩慢吸入（防止小鼠打噴嚏、嗆咳）anti-CCR3 單克隆抗體或同型對(duì)照25 μg 滴鼻加強(qiáng)［11-13］。

2.4 小鼠支氣管哮喘模型霧化激發(fā) 實(shí)驗(yàn)第27、28和29 天，除健康對(duì)照組給予生理鹽水（saline）霧化外，其余組小鼠均給予2% OVA 霧化吸入45 min，當(dāng)小鼠出現(xiàn)擦鼻、流涎、呼吸急促及口唇發(fā)紺、腹式呼吸加快、漸出現(xiàn)呼吸困難時(shí)停止，每天1 次。連續(xù)霧化3 d。

2.5 無創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)小鼠氣道反應(yīng)性 小鼠于霧化結(jié)束后48 h 內(nèi)完成肺功能檢測(cè)。采用全身體積描記法，全身體積描記法具有無約束的特點(diǎn)，可以對(duì)清醒自由活動(dòng)的小動(dòng)物進(jìn)行肺功能及氣道反應(yīng)相關(guān)的測(cè)試，避免了創(chuàng)傷性氣管切開術(shù)及麻醉的影響。無創(chuàng)肺功能儀器可每次檢測(cè)6只小鼠，有6個(gè)傳感器罩，由肺功能檢測(cè)的專門技術(shù)人員調(diào)試機(jī)器與監(jiān)督。無創(chuàng)肺功能檢測(cè)共計(jì)分baseline、NS（生理鹽水）、6.25、12.5、25、50、100和200 mmol/L 乙酰甲膽堿共6 個(gè)梯度，每個(gè)濃度試劑每次給予300 μL 用于霧化，每次霧化1 min，緩沖1 min，作用3 min，記錄1 min。通過霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿，觀察指標(biāo)包括累積氣量、呼吸頻率、吸氣末暫停、最大吸入流速、最大呼出流速等綜合計(jì)算出增強(qiáng)呼氣間歇（enhanced pause，Penh）值，該值與小鼠氣道反應(yīng)的基礎(chǔ)值（baseline）比較，如果在較低的乙酰甲膽堿（methacholine，MCh）濃度下Penh 值呈大幅度上升且變異性大，表明氣道反應(yīng)高，而氣道高反應(yīng)（airway hyperresponsiveness，AHR）是哮喘的重要特點(diǎn)，一般情況下AHR越高，哮喘越重。

2.6 標(biāo)本的收集及處理 各組小鼠經(jīng)麻醉摘眼球取血后，收集至抗凝的EP 管中，并4 ℃靜置0.5 h，1 500 r/min離心10 min后收集分裝血清，并置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。于常?guī)處死小鼠后立即行小鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)：每組小鼠一半行全肺灌洗、一半肺組織用于肺組織切片HE檢測(cè)：即肺組織置入4%多聚甲醛，固定24 h 后進(jìn)行脫水、二甲苯透明、包埋及切片等，用于HE染色。

小鼠肺泡灌洗方法：用75%乙醇將小鼠頸部皮膚進(jìn)行消毒后置小鼠于仰臥位，并用注射器針頭將其固定，用眼科剪小心剪開小鼠頸部皮膚，并用眼科鑷子將皮膚下結(jié)締組織與肌肉進(jìn)行鈍性分離，暴露氣管后，沿隆突方向插入24 G 靜脈留置針，用1 mL注射器抽吸0.8 mL PBS，將PBS 經(jīng)留置針管緩緩注入氣管并將PBS 緩緩回抽，可見回抽出帶乳白色泡沫狀的液體，每次0.8 mL PBS 反復(fù)回抽3 遍，最后可回抽出0.65～0.70 mL 灌洗液，并收集于無菌EP 管中，每只小鼠重復(fù)該灌洗3 次，可收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）約2 mL，以1 500 r/min 將 BALF 離心 10 min 可見離心管底部出現(xiàn)乳白色細(xì)胞沉淀。肺泡灌洗液沉淀用于細(xì)胞計(jì)總數(shù)與細(xì)胞染色計(jì)數(shù)及分類。取上清液分裝，并置于-80 ℃保存用于細(xì)胞因子檢測(cè)。細(xì)胞沉淀經(jīng)100 μL PBS 重懸后取部分涂片，在無菌操作臺(tái)中風(fēng)干后用4%多聚甲醛固定行HE染色。

2.7 ELISA 方法檢測(cè) BALF 中 sPLA2-X、IL-4、IL-5和IL-13及血清中sPLA2-X和總IgE水平 所有檢測(cè)均嚴(yán)格遵照說明書操作，并通過讀取450 nm 處標(biāo)準(zhǔn)品吸光度（A）值，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測(cè)sPLA2-X、IL-4、IL-5和IL-13及總IgE的含量。

以上哮喘模型構(gòu)建、肺功能檢測(cè)及BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法同參考文獻(xiàn)［14-17］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS 18.0 軟件處理數(shù)據(jù)。所有計(jì)量資料均經(jīng)過正態(tài)檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，或非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，并用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)進(jìn)行比較；多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析或SNK-q檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism 6作圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 刪除嗜酸性粒細(xì)胞顯著減輕氣道和肺泡炎癥反應(yīng)

與健康對(duì)照組相比，哮喘對(duì)照組氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肺泡間隔增厚、間隔不連續(xù)或斷裂、肺泡水腫明顯；而嗜酸性粒細(xì)胞刪除組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡水腫、增厚等表現(xiàn)明顯改善，可見視野清晰，間隔連續(xù)，肺泡間隔均勻，少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。該結(jié)果顯示嗜酸性粒細(xì)胞刪除可顯著減輕氣道、肺泡炎癥反應(yīng)。見圖1。

Figure 1.The observation of lung tissues in different groups with HE staining（×200）.Bright blue color indicated that the nuclei was stained with hematoxylin，and the color varies from pink to dark red indicated that the cytoplasm was stained with eosin.圖1 小鼠肺組織病理切片HE染色觀察

2 Anti-CCR3 可成功刪除嗜酸性粒細(xì)胞，并能顯著降低支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞的百分比

與健康對(duì)照組相比較，哮喘模型組小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著升高；與哮喘對(duì)照組比較，哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組小鼠BALF 中的嗜酸性粒細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.01），見圖2。

Figure 2.The cell count and percentage of various types of cells in mouse bronchoalveolar lavage fluid.Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖2 小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)與各類細(xì)胞百分比的比較

3 刪除嗜酸性粒細(xì)胞可降低氣道高反應(yīng)

哮喘對(duì)照組的Penh 值隨著MCH 濃度的遞增上升幅度最大、最顯著；與哮喘對(duì)照組相比較，哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組小鼠的Penh 值隨著MCH 濃度遞增，其上升幅度顯著減低，該結(jié)果表明刪除嗜酸性粒細(xì)胞顯著降低氣道高反應(yīng)，見圖3。

4 刪除嗜酸性粒細(xì)胞的小鼠BALF 中的sPLA2-X水平明顯降低

與健康對(duì)照組相比較，哮喘模型小鼠BALF 中sPLA2-X 表達(dá)的水平顯著增加（P＜0.01）；與哮喘對(duì)照組比較，哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組小鼠BALF 中的sPLA2-X水平明顯降低（P＜0.01），見圖4。

5 刪除嗜酸性粒細(xì)胞小鼠血清中的sPLA2-X 水平明顯降低

與健康對(duì)照組相比較，哮喘模型小鼠血清中的sPLA2-X 水平顯著增加（P＜0.01）；與哮喘對(duì)照組比較，哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組小鼠血清中的sPLA2-X水平明顯降低（P＜0.01），見圖5。

6 刪除嗜酸性粒細(xì)胞可降低小鼠BALF 中IL-4、IL-5和IL-13及血清中IgE的水平

與正常對(duì)照組相比較，哮喘模型小鼠BALF中的IL-4、IL-5和IL-13 及血清中總 IgE 的水平顯著升高，而哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組小鼠BALF 中的IL-4、IL-5和IL-13 及血清中總 IgE 的水平顯著降低（P＜0.01），見圖6～9。

Figure 3.The airway responsiveness of the mice in each group was tested with different concentrations of methacholine.Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group圖3 在不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)下，各組小鼠氣道反應(yīng)性的變化

Figure 4.The levels of sPLA2-X in bronchoalveolar lavage fluid of the mice in different groups.Mean SD. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖4 各組小鼠肺泡灌洗液中sPLA2-X水平的比較

Figure 5.The serum levels of sPLA2-X in the mice of different groups.Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖5 各組小鼠血清中sPLA2-X水平的比較

討 論

Figure 6.The levels of IL-4 in bronchoalveolar lavage fluid of the mice in different groups.The data were presented as median（interquartile range）. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖6 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-4水平的比較

Figure 7.The levels of IL-5 in bronchoalveolar lavage fluid of the mice in different groups.The data were presented as median（interquartile range）. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖7 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-5水平的比較

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子與炎癥介質(zhì)共同作用導(dǎo)致的氣道慢性炎癥疾病。嗜酸性粒細(xì)胞在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［1-3］。目前，雖對(duì)支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的研究已取得進(jìn)步，但支氣管哮喘有不同亞型，不同表型仍需繼續(xù)深入研究其機(jī)制。磷脂酶A2 可水解催化磷脂生成溶血磷脂和自由脂肪酸，而自由脂肪酸是合成前列腺素和花生四烯酸的前體，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。PLA2 水解膜磷脂釋放的炎性或過敏性遞質(zhì)，是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要促進(jìn)因素。磷脂酶A2 廣泛參與人體生理性細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的傳導(dǎo)及病理性炎癥、多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展［3-6］。與磷脂酶A2-X 相關(guān)的研究多集中在巨噬細(xì)胞與氣道上皮細(xì)胞，與嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)的研究國(guó)內(nèi)外鮮少，本研究通過嗜酸性粒細(xì)胞刪除后評(píng)估sPLA2-X 的情況，旨在探索sPLA2-X與嗜酸性粒細(xì)胞的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步明確sPLA2-X與支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系，為哮喘的治療提供新的策略與思路。

Figure 8.The levels of IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid of the mice in different groups.The data were presented as median（interquartile range）. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖8 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-13水平的比較

Figure 9.The serum level of total IgE in the mice of different groups.The data were presented as median（interquartile range）. n=6.##P＜0.01 vs Saline/Saline group；**P＜0.01 vs OVA/Saline group.圖9 各組小鼠血清中總IgE水平的比較

本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比較，哮喘對(duì)照組無論是從病理學(xué)HE 染色分析、BALF 細(xì)胞學(xué)分類、與哮喘相關(guān)的重要細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13 及血清中總IgE水平及氣道反應(yīng)性方面等均顯著增高，與相關(guān)的研究結(jié)果相一致［2-5］，該結(jié)果表明本研究構(gòu)建哮喘模型是成功的。與哮喘對(duì)照組相比較，哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組從BALF細(xì)胞學(xué)分類、嗜酸粒細(xì)胞百分比、BALF 細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13 及血清中總IgE的水平、病理學(xué)改變及肺功能等方面進(jìn)行綜合比較，結(jié)果顯示哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)均有改善。目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)且研究最多的哮喘發(fā)病機(jī)制是Th2 占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2 免疫失衡，Th2 細(xì)胞分泌 IL-4、IL-5、IL-13和IL-9 等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠共同作用于氣道上皮細(xì)胞、黏液細(xì)胞及成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，其中IL-5 可以激活嗜酸性粒細(xì)胞并釋放組胺；IL-4 與IL-13 共同作用于B 淋巴細(xì)胞，并進(jìn)一步產(chǎn)生IgE共同作用于肥大細(xì)胞釋放包括前列腺素、組胺、半胱氨酸、白三烯在內(nèi)的炎癥介質(zhì)；以上細(xì)胞因子及炎癥因子相互作用共同促進(jìn)哮喘的發(fā)生與發(fā)展［1-4］。

本研究結(jié)果顯示嗜酸性粒細(xì)胞刪除組經(jīng)嗜酸性粒細(xì)胞抗體刪除后，顯著減少了Th2 細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13 及血清中總IgE，從而抑制或減輕哮喘的發(fā)生發(fā)展。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道在支氣管哮喘發(fā)病中，肺部富含的PLA2通過從膜磷脂中水解釋放花生四烯酸，進(jìn)一步代謝生成前列腺素和白三烯而釋放大量的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，它將損傷因素、炎癥細(xì)胞、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子和脂類遞質(zhì)等細(xì)胞有形成分和可溶分子物質(zhì)聯(lián)系起來，成為該體系中最重要的活性酶［5-9］。本研究結(jié)果顯示小鼠哮喘模型血清、BALF中sPLA2-X 的水平增高，與相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道一致［7-10］。與哮喘對(duì)照組相比較，哮喘/嗜酸性粒細(xì)胞刪除組血清、BALF 中的sPLA2-X 水平明顯降低，提示刪除嗜酸性粒細(xì)胞可能會(huì)直接或間接導(dǎo)致sPLA2-X 水平的下降，嗜酸性粒細(xì)胞與sPLA2-X存在密切關(guān)聯(lián)。

磷脂酶A2 是一種能催化磷脂甘油分子上二位?；乃饷?，亦是花生四烯酸、前列腺素及血小板活化因子、白三烯等生物活性物質(zhì)生成的限速酶，所產(chǎn)生的脂質(zhì)介質(zhì)在炎癥和組織損傷時(shí)起關(guān)鍵性作用。人類幾乎所有的細(xì)胞均含PLA2，主要為兩種亞細(xì)胞分布，一種為膜結(jié)合性PLA2（Ma-PLA2）、另一種為可溶性PLA2（s-PLA2）。sPLA2-X 是sPLA2的主要亞型之一，主要表達(dá)于哮喘患者氣道的上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞［8-10］，與哮喘的嚴(yán)重程度及氣道高反應(yīng)密切相關(guān)［12］，sPLA2-X 是氣道炎癥中最重要的 PLA2 亞型。嗜酸性粒細(xì)胞在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。在臨床上嗜酸性粒細(xì)胞為主的支氣管哮喘尤為常見，且本研究構(gòu)建的是嗜酸性粒細(xì)胞為主的哮喘模型。相關(guān)研究顯示嗜酸性粒細(xì)胞在過敏原或各種理化因素的作用下，釋放炎癥介質(zhì)包括白三烯、前列腺素等促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展，而磷脂酶A2-X 是白三烯、前列腺素產(chǎn)生關(guān)鍵的限速酶，因此，嗜酸性粒細(xì)胞與磷脂酶A2-X 可能存在重要的關(guān)聯(lián)。結(jié)合以上相關(guān)研究及本研究結(jié)果，嗜酸性粒細(xì)胞可能既是sPLA2-X的重要來源，同時(shí)也可能作為sPLA2-X的效應(yīng)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)如花生四烯酸、白三烯等，共同促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展。