抑制lncRNA LUCAT1表達(dá)通過(guò)靶向調(diào)控miR-204-3p減輕高糖誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞損傷*

陳婉斐， 泮慧俐， 李珍珍， 盧慧琴

（1臺(tái)州市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，浙江臺(tái)州318000；2臺(tái)州市第一人民醫(yī)院新生兒科，浙江臺(tái)州318020）

糖尿病心肌病是由糖尿病引起的可導(dǎo)致心力衰竭的一種病理狀態(tài)［1］，其發(fā)病機(jī)制與心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)［2-4］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 的非編碼 RNA，微小 RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長(zhǎng)度在22 nt 左右的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，兩者均不參與編碼蛋白質(zhì)但參與基因的調(diào)控，且可相互作用，在細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)和功能異常與包括糖尿病心肌病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5-7］。近年來(lái)，有學(xué)者指出，lncRNA 肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（lung cancer-associated transcript 1，LUCAT1）高表達(dá)與糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，抑制其表達(dá)對(duì)高糖（high glucose，HG）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有抑制作用［8］，但具體的作用機(jī)制并不完全清楚。miR-204-3p在lncRNA AK139328介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要的抑制作用［9］。本研究采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LUCAT1 與miR-204-3p 之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)抑制LUCAT1 表達(dá)可能通過(guò)靶向調(diào)控miR-204-3p抑制心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。因此本研究開(kāi)展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，旨在進(jìn)一步揭示敲減LUCAT1 表達(dá)減輕HG 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，為L(zhǎng)UCAT1 成為糖尿病心肌病治療的靶點(diǎn)提供新線索。

材料和方法

1 主要材料

大鼠心肌H9c2 細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究所。DEME 培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；Trizol試劑和Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購(gòu)于南京建成生物公司；RIPA 裂解液、CCK-8 試劑盒、螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；抗Bax、Bax 和GAPDH抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II 抗購(gòu)于北京中杉金橋生物公司；miR-204-3p mimics、miR-204-3p inhibitor 及相應(yīng)的陰性對(duì)照mimics-NC 和inhibitor-NC 購(gòu)于上海吉瑪基因公司；靶向LUCAT1 的干擾序列siRNA-LUCAT1 及其陰性對(duì)照siRNA-NC購(gòu)于廣州銳博生物公司；PCR引物購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購(gòu)于Beckman Coulter；熒光定量PCR 儀購(gòu)于Applied Biosystems；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于Tecan；超微量分光光度計(jì)購(gòu)于Implen；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于Thermo。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 將解凍復(fù)蘇后的H9c2 細(xì)胞以含 5.5 mmol/L D-葡萄糖的 DMEM 培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清）在5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為：（1）對(duì)照（control）組：正常培養(yǎng)72 h；（2）HG 組：以含25.5 mmol/L D-葡萄糖的高糖 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 72 h；（3）HG+siRNA-NC組：轉(zhuǎn)染siRNA-NC 48 h后用高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；（4）HG+siRNA-LUCAT1 組：轉(zhuǎn)染 siRNA-LUCAT1 48 h后用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；（5）HG+siRNALUCAT1+inhibitor-NC 組：共轉(zhuǎn)染 siRNA-LUCAT1 和inhibitor-NC 48 h 后用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h；（6）HG+siRNA-LUCAT1+miR-204-3p inhibitor 組：共轉(zhuǎn)染siRNA-LUCAT1和inhibitor-NC 48 h 后用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。將生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2 細(xì)胞按照每孔5×105個(gè)接種至6 孔細(xì)胞板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；待細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時(shí)，按照上述分組根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)分別將siRNA-LUCAT1、siRNA-NC、miR-204-3p inhibitor和inhibitor-NC 轉(zhuǎn)染 H9c2 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 5 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組以高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.2 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)LUCAT1 和miR-204-3p 的靶向結(jié)合關(guān)系 采用生物學(xué)信息學(xué)軟件對(duì)LUCAT1 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-204-3p與LUCAT1 存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，將該片段克隆重組至螢光素酶報(bào)告載體上，構(gòu)建LUCAT1 野生型載體質(zhì)粒，標(biāo)記為L(zhǎng)UCAT1-WT；同時(shí)，將miR-204-3p 與LUCAT1結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變后，克隆重組至螢光素酶報(bào)告載體上，構(gòu)建LUCAT1 突變型載體質(zhì)粒，標(biāo)記為L(zhǎng)UCAT1-MUT。參照Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)將LUCAT1-WT、LUCAT1-MUT 質(zhì)粒分別與 miR-204-3p mimics、mimics-NC 共轉(zhuǎn)染至 H9c2 細(xì)胞中，其中每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行孔；轉(zhuǎn)染48 h 后，收集各組細(xì)胞并參照螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的螢光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 RT-qPCR檢測(cè)LUCAT1和miR-204-3p的表達(dá)Trizol 法提取H9c2 細(xì)胞的總RNA 后，采用微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的濃度、純度及完整性。將高質(zhì)量的RNA 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟合成cDNA；將cDNA 作為模板，按照熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)上PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，38 個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸5 min。所用到的PCR 引物序列如下：LUCAT1 的上游引物序列為5'-GCTCGGATTGCCTTAGACAG-3'，下游引物序列為5'-GGGTGAGCTTCTTGTGAGGA-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物序列為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；miR-204-3p 的上游引物序列為5'-ACACTCCAGCTGGGGCTGGGAAGGCAAAGGG-3'，下游引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCG-TGGA-3'；U6 的上游引物序列為5'-CTCACTTCGGCAGCACATA-3'，下游引物序列為5'-AACTCTTCACGATTTTGTCTGTC-3'。

2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞的活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2 細(xì)胞按照每孔 1×105個(gè)接種至 96 孔細(xì)胞板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；將其按照2.1 中的分組與處理，并將無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白調(diào)零孔；處理72 h 后，每孔加入 CCK-8 工作液 100 μL；孵育 4 h 后，采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)H9c2 細(xì)胞在490 nm 波長(zhǎng)處的A值，并計(jì)算出各組細(xì)胞的相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零組A值）/（對(duì)照組A值-調(diào)零組A值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 LDH 試劑盒檢測(cè)LDH 漏出量 按照2.1 中的分組處理H9c2 細(xì)胞72 h 后，收集各組細(xì)胞上清液，參照LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中LDH活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照2.1 中的分組處理H9c2 細(xì)胞72 h 后，收集各組細(xì)胞，以預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌 2 次后，加入 1× binding buffer 制成濃度為1×109/L的細(xì)胞懸液；取細(xì)胞懸液100 μL于樣品管中，加入5 μL annexin V-FITC 和5 μL PI；混勻后，室溫避光放置15 min；補(bǔ)加1× binding buffer 400 μL后，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中 Bcl-2和Bax 蛋白的表達(dá) 向H9c2 細(xì)胞中加入RIPA 裂解液抽提細(xì)胞總蛋白后，參照BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)蛋白的濃度與純度；將蛋白樣品按照1∶1 比例與上樣緩沖液混勻后，以每孔50 μg 上樣至SDS-PAGE 凝膠孔中行電泳分離；電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。采用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h 后，加入按照1∶1 000比例稀釋的抗Bcl-2、Bax 和GAPDH 抗體；4℃孵育過(guò)夜后，加入按照1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II 抗；室溫孵育2 h 后，滴加化學(xué)發(fā)光劑；暗室內(nèi)顯影曝光后，以GAPDH 為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析H9c2 細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 比色法檢測(cè)SOD和GSH-Px活性及MDA含量按照2.1 中的分組處理H9c2 細(xì)胞后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞后，1 000 r/min 離心10 min；取200 μL上清液后，參照SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各處理組中SOD 和GSHPx活性及MDA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3 次實(shí)驗(yàn)的均值，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LUCAT1和miR-204-3p的靶向結(jié)合關(guān)系

LncBase Predicted v.2 軟件預(yù)測(cè)到 LUCAT1 和miR-204-3p 之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖1A。采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步檢測(cè)LUCAT1 和miR-204-3p 的靶向結(jié)合關(guān)系，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照mimics-NC 組比較，miR-204-3p mimics 與 LUCAT1-WT 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后H9c2 細(xì)胞的螢光素酶活性明顯降低（P＜0.05），但miR-204-3p mimics 與LUCAT1-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后H9c2 細(xì)胞的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The complementary binding sites between LUCAT1 and miR-204-3p（A）and the changes of luciferase activity（B）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs mimics-NC group.圖1 LUCAT1和miR-204-3p之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)及螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的驗(yàn)證

2 轉(zhuǎn)染后各組心肌細(xì)胞中LUCAT1 和miR-204-3p表達(dá)水平的變化

與對(duì)照組比較，給予HG 刺激后H9c2 細(xì)胞中LUCAT1 的表達(dá)水平明顯升高，而miR-204-3p 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與 HG 組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-NC 后 H9c2 細(xì) 胞中 LUCAT1和miR-204-3p 的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染siRNA-LUCAT1 后 H9c2 細(xì)胞中 LUCAT1 的表達(dá)水平明顯降低，miR-204-3p 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與HG+siRNA-LUCAT1 組比較，轉(zhuǎn)染inhibitor-NC 對(duì)H9c2 細(xì)胞中miR-204-3p 的表達(dá)水平無(wú)明顯影響（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染 miR-204-3p inhibitor 后H9c2 細(xì)胞中 miR-204-3p 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 LUCAT1 低表達(dá)靶向調(diào)控 miR-204-3p 對(duì) HG 環(huán)境下心肌細(xì)胞活力和LDH漏出量的影響

與對(duì)照組比較，HG 組H9c2 細(xì)胞的活力明顯降低，而 LDH 漏出量明顯升高（P＜0.05）；與 HG 組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-NC 后H9c2 細(xì)胞的活力和LDH 漏出量均無(wú)顯著改變（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染siRNA-LUCAT1后H9c2細(xì)胞的活力明顯升高，而LDH 漏出量明顯降低（P＜0.05）；與HG+siRNA-LUCAT1組比較，轉(zhuǎn)染inhibitor-NC 對(duì)H9c2 細(xì)胞的活力和LDH 漏出量無(wú)明顯影響（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染miR-204-3p inhibitor 后H9c2細(xì)胞的活力明顯降低，而LDH 漏出量明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 2.Comparison of expression levels of LUCAT1 and miR-204-3p in H9c2 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.圖2 各組H9c2 細(xì)胞中LUCAT1 和miR-204-3p 表達(dá)水平的比較

4 LUCAT1 低表達(dá)靶向調(diào)控 miR-204-3p 對(duì) HG 環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，HG組H9c2細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與HG 組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-NC 對(duì)H9c2細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染siRNALUCAT1 可明顯抑制 HG 誘導(dǎo)的 H9c2 細(xì)胞凋亡（P＜0.05）；與HG+siRNA-LUCAT1 組比較，轉(zhuǎn)染inhibitor-NC 對(duì)H9c2 細(xì)胞的凋亡無(wú)顯著影響（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染miR-204-3p inhibitor后siRNA-LUCAT1對(duì)HG 環(huán)境下H9c2 細(xì)胞凋亡的抑制作用明顯減弱（P＜0.05）， 見(jiàn)圖4。

Figure 3.Comparison of the viability（A）and LDH leakage（B）in the H9c2 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.圖3 各組H9c2細(xì)胞活力和LDH漏出量的比較

Figure 4.The apoptosis of the H9c2 cells in each group detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡的變化

5 LUCAT1 低表達(dá)靶向調(diào)控 miR-204-3p 對(duì) HG 環(huán)境下心肌細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，HG 組H9c2細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而B(niǎo)ax 的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與HG 組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-NC 對(duì)H9c2細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染 siRNA-LUCAT1 可明顯上調(diào) HG 環(huán)境下H9c2 細(xì)胞中Bcl-2 的蛋白表達(dá)并下調(diào)Bax 的蛋白表達(dá)（P＜0.05）；與HG+siRNA-LUCAT1 組比較，轉(zhuǎn)染inhibitor-NC 對(duì) H9c2 細(xì)胞中 Bcl-2和Bax 的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染miR-204-3p inhibitor 可明顯逆轉(zhuǎn) siRNA-LUCAT1 對(duì) Bcl-2 蛋白表達(dá)的促進(jìn)及對(duì)Bax 蛋白表達(dá)的抑制作用（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

Figure 5.The protein expression of Bcl-2 and Bax in the H9c2 cells of each group determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.圖5 Western blot檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

6 LUCAT1 低表達(dá)靶向調(diào)控miR-204-3p 對(duì)心肌細(xì)胞SOD和GSH-Px活性及MDA含量的影響

與對(duì)照組比較，HG 組H9c2細(xì)胞的SOD 和GSHPx 活性均明顯降低，而MDA 含量明顯升高（P＜0.05）；與 HG 組比較，轉(zhuǎn)染 siRNA-LUCAT1 可明顯逆轉(zhuǎn) HG 引起的 H9c2 細(xì)胞 SOD和GSH-Px 活性及 MDA含量的變化（P＜0.05），但轉(zhuǎn)染siRNA-NC 對(duì)HG 環(huán)境下 H9c2 細(xì)胞的 SOD和GSH-Px 活性及 MDA 含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）；與HG+siRNA-LUCAT1 組比較，轉(zhuǎn)染 inhibitor-NC 對(duì) HG 環(huán)境下 H9c2 細(xì)胞的 SOD 和GSH-Px活性及MDA含量無(wú)顯著影響（P＞0.05），但轉(zhuǎn)染miR-204-3p inhibitor 可明顯逆轉(zhuǎn)siRNA-LUCAT1對(duì) HG 環(huán)境下 H9c2 細(xì)胞 SOD和GSH-Px 活性及 MDA含量的作用（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

Figure 6.The activity of SOD and GSH-Px and the content of MDA in the H9c2 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group；&P＜0.05 vs HG+siRNA-LUCAT1 group.圖6 各組H9c2細(xì)胞SOD和GSH-Px活性及MDA含量的比較

討 論

糖尿病是一種快速增長(zhǎng)的流行疾病，而糖尿病心肌病是其最主要的并發(fā)癥之一，對(duì)糖尿病患者的生命健康和生活質(zhì)量帶來(lái)很大的威脅［10］。血糖升高與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，高血糖可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，改變心肌結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而加重糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展［11-12］。本研究以含25.5 mmol/L D-葡萄糖［13］的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞活力、SOD 活性、GSH-Px 活性和抑凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平均明顯降低，而細(xì)胞膜損傷指標(biāo)LDH 釋放量、細(xì)胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平和氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA 含量均明顯升高，即HG 可引起心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，降低細(xì)胞活力。這表明HG誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。在糖尿病心肌病患者中存在著異常表達(dá)的lncRNAs，而這些lncRNAs 可能通過(guò)調(diào)控HG 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展［5，14-15］。作為 lncRNAs 家族成員，LUCAT1（又名SCAL1）定位于人5 號(hào)染色體上，由香煙煙霧抽提物誘導(dǎo)產(chǎn)生，在肺癌、胃癌、肝癌等腫瘤中異常高表達(dá)，且可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移等發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［16］。此外，LUCAT1 異 常活化可通過(guò)下調(diào)DNMT1 表達(dá)參與 PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［17］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病的發(fā)展機(jī)制與LUCAT1有關(guān)，敲減LUCAT1 的表達(dá)能減輕HG 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［8］，但具體的保護(hù)機(jī)制并不完全清楚。

miRNAs 是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的內(nèi)源性非編碼RNA，其異常表達(dá)可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)等參與包括糖尿病心肌病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展［18-20］。lncRNAs 常被作為 miRNA的海綿吸附因子，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控miRNA 的表達(dá)而發(fā)揮功能［21］。本研究采用生物信息學(xué)軟件對(duì)LUCAT1 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-204-3p 與LUCAT1 之間存在潛在相互作用。研究顯示，miR-204-3p 異常表達(dá)可調(diào)控細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)與白內(nèi)障等疾病的發(fā)病有關(guān)［22］。過(guò)表達(dá) miR-204-3p 通過(guò)靶向緩激肽 B2 受體在HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和功能障礙中發(fā)揮保護(hù)作用［23］。此外，在糖尿病心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞和組織中miR-204-3p 表達(dá)下調(diào)，抑制lncRNA AK139328 通過(guò)上調(diào)miR-204-3p 減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷［9］。本研究結(jié)果顯示，HG 刺激后心肌細(xì)胞中LUCAT1 表達(dá)上調(diào)，而miR-204-3p 表達(dá)下調(diào)；采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，LUCAT1 可與miR-204-3p 靶向結(jié)合降低心肌細(xì)胞的螢光素酶活性；此外，成功下調(diào)LUCAT1 表達(dá)可明顯抑制HG 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和Bax 蛋白表達(dá)，降低LDH 釋放量和MDA 含量，并上調(diào)心肌細(xì)胞中miR-204-3p 表達(dá)和Bcl-2 蛋白表達(dá)，提高心肌細(xì)胞活力及SOD 和GSH-Px 活性；而成功下調(diào)miR-204-3p 表達(dá)后，LUCAT1 低表達(dá)對(duì)HG 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用明顯逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果表明，敲減LUCAT1 的表達(dá)可通過(guò)靶向上調(diào)miR-204-3p 抑制HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕心肌細(xì)胞損傷。下一步我們將研究miR-204-3p是否特異影響凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，敲減LUCAT1 的表達(dá)可通過(guò)靶向調(diào)控miR-204-3p 表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，從而減輕HG 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。這為在糖尿病心肌病中調(diào)控LUCAT1 的表達(dá)水平以保護(hù)心肌細(xì)胞提供了新的參考依據(jù)。