單重PCR 鑒別犬4 種布魯氏菌檢測方法的建立

徐懷英，黃迪海，仉 偉，郝文娟，盛曉丹，秦卓明，2

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，山東濟(jì)南 250100；3.濟(jì)南市動物生物藥品工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南 250100；4.濟(jì)南市動物園服務(wù)中心，山東濟(jì)南 250031）

布魯氏菌?。╞rucellosis）是一種人獸共患病，由布魯氏菌屬細(xì)菌侵入宿主機(jī)體引起，其臨床發(fā)病特點(diǎn)為被感染人和動物長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛以及肝脾腫大等，且可引起生殖系統(tǒng)疾病，公共衛(wèi)生意義巨大。

布魯氏菌屬的4 個(gè)種均可以感染犬，包括：羊種布魯氏菌（B.melitensis）、牛種布魯氏菌（B.abortus）、豬種布魯氏菌（B.suis）和犬種布魯氏菌（B.canis）[1]。犬種布魯氏菌生長菌落為天然粗糙型，而牛種、羊種、豬種布魯氏菌生長菌落一般是光滑型。由犬種布魯氏菌引起的犬布魯氏菌病稱為最適寄生型，由其他3 種布魯氏菌引起的犬布魯氏菌病稱為轉(zhuǎn)移型。在牧區(qū)，由于犬多為散養(yǎng)，生食病死畜禽現(xiàn)象普遍存在，犬布魯氏菌感染率較高，抗體陽性率介于8.16%～42.65%[2-3]。2016—2017 年的濟(jì)南市寵物犬布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，光滑型布魯氏菌抗體陽性率為8.76%，粗糙型布魯氏菌為1.99%[4]，表明在寵物犬中存在不同程度的布魯氏菌感染，潛在傳播風(fēng)險(xiǎn)較大。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種快速、特異、敏感的分子檢測方法。我國已經(jīng)建立了Bruce-Ladder PCR 檢測布魯氏菌的國家診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646—2018），但該方法需要首先對病原菌進(jìn)行分離和純培養(yǎng)，不適宜在基層推廣應(yīng)用。本研究根據(jù)粗糙型布魯氏菌wbkD及wbkF基因序列缺失351 bp 的特點(diǎn)[5]，通過設(shè)計(jì)1 對引物并優(yōu)化反應(yīng)條件建立了PCR 檢測方法。該方法可同時(shí)鑒別診斷4 種布魯氏菌（犬種、牛種、羊種和豬種），既適用于病原菌的純培養(yǎng)物，又適合于感染犬的血液、流產(chǎn)或排泄物樣品的檢測，且能一次性區(qū)分光滑型（牛種、羊種和豬種）和粗糙型（犬種）布魯氏菌，適合于基層推廣和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株B.abortus、B.melitensis、B.suis和B.canis滅活菌液，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所丁家波研究員惠贈；大腸桿菌及沙門氏菌，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所保存。

1.1.2 犬布魯氏菌陽性血液樣品。經(jīng)布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原檢測為陽性的20 份犬布魯氏菌血液樣品。

1.1.3 主要試劑及儀器 10×PCR Buffer、TaqDNA 聚合酶、dNTP，均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DL 2 000 bp DNA Marker、DL 1 000 bp DNA Marker，均購自寶生物（北京）有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖，購自Biowest公司；NanoDropTMOne/OneC 超微量紫外分光光度計(jì)、PCR 儀，均購自Thermo Fisher 公司；Tanon 1600 凝膠圖像分析系統(tǒng)，購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA 的提取 按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書，提取上述細(xì)菌的基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 下載GenBank 中登錄的B.abortus、B.melitensis、B.suis和B.canis基因組序列并進(jìn)行比對，根據(jù)B.canis基因組中wbkD、wbkF基因序列差異，應(yīng) 用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)1 對引物（BF：5'-TCTA TTATTACGGACGGCTGGCTGAG-3'；BR：5'-GTGGTGGCCCATGTGGCGCTT-3'）。引物送北京六合華大基因科技股份有限公司合成。其中，牛種、羊種、豬種布魯氏菌目的片段長度預(yù)計(jì)均為717 bp；犬種布魯氏菌缺失351 bp，目的片段長度預(yù)計(jì)為366 bp。

1.2.3 反應(yīng)體系建立及條件優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 0.25 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，待檢DNA 模板2 μL，引物BF 和BR（10 mmol/L）各1 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，最后用RNA-free 補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，分別設(shè)置6 個(gè)退火溫度（52、54、56、58、60 和62 ℃）退火30 s，72 ℃延伸40 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 特異性試驗(yàn) 按照優(yōu)化的PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，分別對4種布魯氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌基因組DNA 進(jìn)行序列擴(kuò)增，然后將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證反應(yīng)的特異性。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 將4種基因組DNA（犬種、羊種、牛種和豬種）樣品分別用NanoDrop ? One/OneC 超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量和純度測定，然后對各樣品10 倍倍比稀釋6 個(gè)梯度，各取2 μL不同含量的模板，使用引物BF 和BR 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，驗(yàn)證該檢測方法的靈敏性。

1.2.6 臨床應(yīng)用 選擇20 只發(fā)生過流產(chǎn)的布魯氏菌血清學(xué)陽性雌犬，每只犬后肢靜脈采集抗凝血1份。參照文獻(xiàn)[6]中布魯氏菌抗凝血樣DNA 提取方法提取基因組DNA，利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR 檢測，檢測該方法在臨床上的應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

在52、54 ℃退火溫度下，PCR 反應(yīng)條帶較亮；56、58 ℃退火溫度下，PCR 反應(yīng)條帶逐漸變暗；60、62 ℃退火溫度下，未觀察到PCR 條帶（圖1）。通過優(yōu)化試驗(yàn)，確定該引物退火溫度為54 ℃。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。

圖1 不同退火溫度對牛種、羊種、豬種和犬種布魯氏菌PCR 反應(yīng)的影響

2.2 特異性試驗(yàn)

利用建立的PCR 反應(yīng)體系，對牛種、羊種和豬種布魯氏菌均能擴(kuò)增出預(yù)期的717 bp目的條帶，對犬種布魯氏菌能擴(kuò)增出366 bp 目的條帶，而對大腸桿菌、沙門氏菌，均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，表明建立的PCR 方法特異性較好（圖2）。

圖2 PCR 方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性試驗(yàn)

經(jīng)NanoDrop ? One/OneC 超微量紫外分光光度計(jì)測定，犬種、羊種、豬種和牛種布魯氏菌基因組DNA 濃度分別為50.7、62.0、78.0 及55.0 ng/μL，分別10 倍倍比稀釋6 個(gè)梯度，然后進(jìn)行PCR 并將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖3）。

圖3 4種布魯氏菌PCR 反應(yīng)的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

從圖3 可以看出，當(dāng)犬種布魯氏菌基因組DNA 濃度為5.07×（10-2～101）ng/μL 時(shí)，利用建立的PCR 方法擴(kuò)增后均有明顯特異性條帶，擴(kuò)增片段大小為366 bp；當(dāng)濃度等于或小于5.07×10-3ng/μL時(shí)，均無擴(kuò)增條帶。當(dāng)羊種布魯氏菌基因組DNA濃度為6.20×（10-2～101）ng/μL 時(shí)，PCR 擴(kuò)增后均有明顯特異性條帶，擴(kuò)增片段大小為717 bp；當(dāng)濃度等于或小于6.20×10-3ng/μL 時(shí)，均無擴(kuò)增條帶。當(dāng)豬種布魯氏菌基因組DNA 濃度為7.80×（10-3～101）ng/μL 時(shí)，PCR 擴(kuò)增后均有明顯特異性條帶，擴(kuò)增片段大小為717 bp；當(dāng)濃度等于或小于7.80×10-4ng/μL 時(shí)，均無擴(kuò)增條帶。當(dāng)牛種布魯氏菌基因組DNA 濃度為5.50×（10-2～101）ng/μL 時(shí)，PCR 擴(kuò)增后均有明顯特異性條帶，擴(kuò)增片段大小為717 bp；當(dāng)濃度等于或小于5.50×10-3ng/μL 時(shí)，均無擴(kuò)增條帶。

由此可見，該方法能檢測到犬種、羊種、豬種和牛種布魯氏菌基因組DNA 最低濃度分別為5.07×10-2、6.20×10-2、7.80×10-3和5.50×10-2ng/μL，表明本方法的檢測靈敏度較高。

2.4 寵物犬布魯氏菌臨床檢測

對20 份寵物犬布魯氏菌血清學(xué)檢測為陽性的血液樣品進(jìn)行PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)5、11 和15 號樣品在366 bp 處擴(kuò)增出特異性條帶（圖4），表明上述3 份樣品犬種布魯氏菌病原陽性。將這3 份抗凝血樣品送中國獸藥監(jiān)察所進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，共分離到2 株犬種布魯氏菌。

圖4 臨床血液樣品布魯氏菌PCR 檢測結(jié)果

3 討論

感染犬的4 種布魯氏菌均可感染人，其中以羊種布魯氏菌毒力和傳播性最強(qiáng)，牛種和豬種其次，犬種最弱[7]。伴隨著人民生活水平的提高，城鎮(zhèn)家庭飼養(yǎng)寵物犬?dāng)?shù)量龐大，截至2018 年12 月，我國寵物犬?dāng)?shù)量已高達(dá)7 400 萬只，已有多例人通過密切接觸犬而感染布魯氏菌的報(bào)道[8-10]。因此，高度關(guān)注犬布魯氏菌感染，對于保障人類和寵物健康意義重大。

細(xì)菌的分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷是布魯氏菌病檢測的主要手段，從血液、流產(chǎn)胎兒、陰道分泌物等材料中分離到布魯氏菌是最具診斷性的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但由于該病菌對人具有感染性，因此，必須在有資質(zhì)的P3 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離。同時(shí)該菌分離受采樣時(shí)機(jī)等因素影響較大，分離率較低，不利于布魯氏菌病的早期診斷。血清學(xué)診斷便捷簡單，但虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）和試管凝集試驗(yàn)（SAT）易出現(xiàn)假陽性，常用于布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查時(shí)的初篩，而ELISA 抗體檢測易出現(xiàn)假陰性[11]。本研究建立的單重PCR 可一次性鑒別粗糙型（犬種）與光滑型（羊種、牛種和豬種）布魯氏菌，且在檢測時(shí)可以直接采取病料組織，十分便捷，方便在基層推廣應(yīng)用。

利用本試驗(yàn)建立的單重PCR 方法對20 份布魯氏菌血清學(xué)陽性犬血清進(jìn)行檢測，共檢出3 份犬種布魯氏菌陽性樣品。將該批血液樣品送中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所布魯氏菌檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行GB/T 18646—2018 引物的PCR 檢測，結(jié)果一致。推測可能是由于犬種布魯氏菌為粗糙型，而其種他為光滑型，不同生物型布魯氏菌與機(jī)體作用機(jī)制不同。

布魯氏菌不同種菌株間基因組同源性非常高[12-13]，如布魯氏菌16S rDNA 核苷酸序列相似性達(dá)99.6%～100%。已建立的聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RELP）需在單菌落純化后進(jìn)行[14]，其他多重PCR 方法需要至少添加4 對以上的引物進(jìn)行擴(kuò)增[15]。本研究利用犬種布魯氏菌在wbkD與wbkF基因序列缺失351 bp 的特點(diǎn)，通過犬種與其他3 種布魯氏菌擴(kuò)增長度的差異，確定是犬種還是其他布魯氏菌種。該方法為犬布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查提供了便捷、特異性好、敏感性高的診斷技術(shù)，適于寵物門診及基層研究單位對犬布魯氏菌病盡早鑒別診斷，以盡快采取治療或撲殺措施。