兩種虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測羊布魯氏菌病效果比較

董 浩，彭小薇，馮 宇，原 霖，畢一鳴，趙柏林，穆佳毅，左海莉，鄒曉娟，王傳彬

（1.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 102618；3.包頭市九原區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古包頭 014060；4.乳山市徐家鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東乳山 264500）

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布?。┦怯刹剪斒暇鷮偌?xì)菌引起牛、羊、豬、鹿、犬等多種哺乳動(dòng)物和人類共患的一種傳染病，為我國二類動(dòng)物疫病。布病全球流行，已有170 多個(gè)國家有人間和畜間布病病例的報(bào)道[1]。動(dòng)物布病以母畜流產(chǎn)和公畜睪丸炎為主要特征；人布病以發(fā)熱、乏力、流產(chǎn)、睪丸炎等為主要癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至喪失勞動(dòng)能力和生育能力。該病嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2019 年我國人間布病新增病例44 036 例，發(fā)病率高達(dá)3.1/（10 萬），同2018 年的新增病例數(shù)相比增加了16%。

我國現(xiàn)行的動(dòng)物布病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646—2018）規(guī)定了多種布病血清學(xué)檢測方法，如虎紅平板凝集（RBPT）、試管凝集（SAT）、間接ELISA（iELISA）、競爭ELISA（cELISA）和補(bǔ)體結(jié)合（CFT）等試驗(yàn)方法[2]。其中，RBPT操作簡單、試劑便宜、試驗(yàn)耗時(shí)短，在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物布病檢測中應(yīng)用非常廣泛。但該方法也存在一定的缺陷：敏感性低于ELISA、熒光偏振（FPA）、CFT 和膠體金；特異性也不高，需用SAT、ELISA 或CFT 等進(jìn)行確診[3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）在發(fā)布的《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》[4]中推薦了一種改良的RBPT 方法，用于對小反芻獸血清樣品檢測，即使用3 倍血清與1 倍虎紅平板凝集抗原混合進(jìn)行檢測。而我國現(xiàn)行的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646—2018）中的RBPT 方法，則是使用等量的動(dòng)物血清與虎紅平板凝集抗原混合進(jìn)行檢測。為評價(jià)這兩種RBPT 方法對羊血清的布病檢測效果，采用兩種RBPT 方法，對來自免疫羊場、非免疫羊場和布病陰性羊群的239 份血清樣品進(jìn)行了檢測，同時(shí)以cELISA 和SAT 進(jìn)行符合檢測。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

免疫場、非免疫場的綿羊血清各92 份，采自內(nèi)蒙古自治區(qū)，其中免疫場血清為S2 疫苗注射免疫10 個(gè)月后采集。陰性綿羊血清55 份，采自遼寧省和河北省的陰性羊群。

1.2 試劑

布魯氏菌RBPT 抗原、SAT 抗原、cELISA 試劑盒，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 方法

常規(guī)RBPT、SAT（微量法）和cELISA 試驗(yàn)，均按照我國動(dòng)物布病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646—2018）進(jìn)行。改良RBPT 試驗(yàn)，按照OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》中檢測小反芻獸疫的RBPT 方法，使用75 μL 羊血清和25 μL RBPT 抗原混合4 min 后觀察結(jié)果。

對免疫、非免疫和陰性綿羊血清的兩種RBPT檢測結(jié)果進(jìn)行敏感性和特異性對比，并以cELISA為“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行符合率對比。同時(shí)，對常規(guī)RBPT、改良RBPT 和cELISA 檢測結(jié)果不一致的樣品，采用SAT（微量法）進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 RBPT 檢測

在239 份羊血清檢測中，用常規(guī)RBPT 檢出44 份非免疫場、55 份免疫場陽性血清，而用改良RBPT 分別檢出65、88 份。55 份陰性血清均為陰性（表1）。

表1 兩種RBPT 檢測羊血清樣品結(jié)果 單位：份

2.2 cELISA 檢測

采用cELISA 檢測239 份羊血清，結(jié)果檢出61 份非免疫場、62 份免疫場陽性血清，55 份陰性血清全部為陰性（表2）。

表2 cELISA 試驗(yàn)檢測羊血清樣品結(jié)果 單位：份

2.3 對比分析

在檢測非免疫場羊血清樣品時(shí)，常規(guī)RBPT 的敏感性為68.85%（42/61），特異性為93.55%（29/31），與cELISA 的符合率為77.17%（71/92）；在檢測免疫場羊血清樣品時(shí)，敏感性為75.81%（47/62），特異性為73.33%（22/30），與cELISA 的符合率為75.00%（69/92）。

在檢測非免疫場羊血清樣品時(shí)，改良RBPT的敏感性為91.80%（56/61），特異性為70.97%（22/31），與cELISA 的符合率為84.78%（78/92）；在檢測免疫場羊血清樣品時(shí)，敏感性為98.39%（61/62），特異性為10%（3/30），與cELISA 試驗(yàn)的符合率為69.57%（64/92）。

在檢測55 份陰性血清時(shí)，兩種RBPT 和cELISA 檢測全部為陰性，符合率為100%。

2.4 SAT 驗(yàn)證

對33 份常規(guī)RBPT 檢測為陰性，而改良RBPT 和cELISA 檢測均為陽性的樣品，采用SAT法（微量法）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果可疑的16 份，陽性的5 份（表3）。

表3 試管凝集試驗(yàn)對兩種檢測方法結(jié)果的驗(yàn)證 單位：份

3 討論

20 世紀(jì)50 年代，布病曾在我國廣泛流行。隨著防控力度的不斷增強(qiáng)，20 世紀(jì)80—90 年代，我國布病疫情降至歷史最低水平。然而，2000 年以來，隨著我國家畜飼養(yǎng)量不斷增加，動(dòng)物及其產(chǎn)品流通頻繁，部分地區(qū)布病暴發(fā)呈持續(xù)上升勢頭，嚴(yán)重威脅了畜牧業(yè)生產(chǎn)和人民群眾的身體健康。2013—2017 年，國家動(dòng)物布病參考實(shí)驗(yàn)室對有流產(chǎn)癥狀的布病非免疫牛場采集血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果布魯氏菌血清抗體平均個(gè)體陽性率高達(dá)44.2%[5]。

根據(jù)《國家布魯氏菌病防治計(jì)劃（2016—2020 年）》的相關(guān)要求，實(shí)驗(yàn)室檢測也是畜間布病防治的重要技術(shù)措施，縣級動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)具備開展布病血清學(xué)檢測能力，省級動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)能有效開展布病病原學(xué)檢測工作[1]。因此，家畜布病診斷技術(shù)研究對于布病防控具有重要意義。

本研究比較了常規(guī)RBPT 和改良RBPT 對羊血清樣品的檢測情況，同時(shí)按照我國現(xiàn)行動(dòng)物布病的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646—2018），采用cELISA 和SAT 進(jìn)行確診，結(jié)果改良RBPT 比常規(guī)RBPT 多檢測出33 份cELISA 檢測陽性樣品，其中16 份經(jīng)SAT 判定為可疑，5 份判定為陽性，沒有出現(xiàn)RBPT 檢測為陰性而常規(guī)RBPT 檢測為陽性的樣品，說明改良RBPT 在檢測羊血清樣品時(shí)的敏感性要高于常規(guī)RBPT。因此，用改良RBPT 在存在陽性動(dòng)物的羊群中開展檢測，更容易篩選到抗體滴度較低的陽性動(dòng)物，從而減少漏檢率。

特異性方面，在檢測非免疫場和免疫場血清樣品時(shí)，改良RBPT 都低于常規(guī)RBPT。值得注意的是，當(dāng)使用改良RBPT 檢測免疫場的羊血清樣品時(shí)，該方法的特異性僅為10%，這與采用該方法對55 份陰性羊場的血清樣品檢測無假陽性出現(xiàn)的結(jié)果存在較大差異。對cELISA 試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析表明，27 份cELISA 檢測為陰性而改良RBPT 檢測為陽性的免疫場羊血清中，有19 份抑制率介于20%～30%。由于本研究免疫場的羊血清樣品為S2 疫苗注射免疫10 個(gè)月后所采集，此時(shí)大部分免疫羊的布病免疫抗體剛好降低到cELISA檢測臨界值之下（抑制率小于30%），所以采用cELISA 檢測時(shí)為陰性。

4 結(jié)論

綜上所述，改良RBTP 的敏感性要高于常規(guī)RBPT，可以在陽性羊群中篩選到更多抗體效價(jià)較低的早期感染動(dòng)物。但改良RBTP 特異性有一定程度的降低，必須結(jié)合SAT、cELISA 等特異性高的方法進(jìn)行確診，以避免對假陽性動(dòng)物的“誤殺”。