董 浩,彭小薇,馮 宇,原 霖,畢一鳴,趙柏林,穆佳毅,左海莉,鄒曉娟,王傳彬
(1.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,北京 100125;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 102618;3.包頭市九原區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,內(nèi)蒙古包頭 014060;4.乳山市徐家鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,山東乳山 264500)
布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布?。┦怯刹剪斒暇鷮偌?xì)菌引起牛、羊、豬、鹿、犬等多種哺乳動(dòng)物和人類共患的一種傳染病,為我國二類動(dòng)物疫病。布病全球流行,已有170 多個(gè)國家有人間和畜間布病病例的報(bào)道[1]。動(dòng)物布病以母畜流產(chǎn)和公畜睪丸炎為主要特征;人布病以發(fā)熱、乏力、流產(chǎn)、睪丸炎等為主要癥狀,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,甚至喪失勞動(dòng)能力和生育能力。該病嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),2019 年我國人間布病新增病例44 036 例,發(fā)病率高達(dá)3.1/(10 萬),同2018 年的新增病例數(shù)相比增加了16%。
我國現(xiàn)行的動(dòng)物布病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18646—2018)規(guī)定了多種布病血清學(xué)檢測方法,如虎紅平板凝集(RBPT)、試管凝集(SAT)、間接ELISA(iELISA)、競爭ELISA(cELISA)和補(bǔ)體結(jié)合(CFT)等試驗(yàn)方法[2]。其中,RBPT操作簡單、試劑便宜、試驗(yàn)耗時(shí)短,在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物布病檢測中應(yīng)用非常廣泛。但該方法也存在一定的缺陷:敏感性低于ELISA、熒光偏振(FPA)、CFT 和膠體金;特異性也不高,需用SAT、ELISA 或CFT 等進(jìn)行確診[3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)在發(fā)布的《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》[4]中推薦了一種改良的RBPT 方法,用于對小反芻獸血清樣品檢測,即使用3 倍血清與1 倍虎紅平板凝集抗原混合進(jìn)行檢測。而我國現(xiàn)行的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18646—2018)中的RBPT 方法,則是使用等量的動(dòng)物血清與虎紅平板凝集抗原混合進(jìn)行檢測。為評價(jià)這兩種RBPT 方法對羊血清的布病檢測效果,采用兩種RBPT 方法,對來自免疫羊場、非免疫羊場和布病陰性羊群的239 份血清樣品進(jìn)行了檢測,同時(shí)以cELISA 和SAT 進(jìn)行符合檢測。
免疫場、非免疫場的綿羊血清各92 份,采自內(nèi)蒙古自治區(qū),其中免疫場血清為S2 疫苗注射免疫10 個(gè)月后采集。陰性綿羊血清55 份,采自遼寧省和河北省的陰性羊群。
布魯氏菌RBPT 抗原、SAT 抗原、cELISA 試劑盒,均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
常規(guī)RBPT、SAT(微量法)和cELISA 試驗(yàn),均按照我國動(dòng)物布病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18646—2018)進(jìn)行。改良RBPT 試驗(yàn),按照OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》中檢測小反芻獸疫的RBPT 方法,使用75 μL 羊血清和25 μL RBPT 抗原混合4 min 后觀察結(jié)果。
對免疫、非免疫和陰性綿羊血清的兩種RBPT檢測結(jié)果進(jìn)行敏感性和特異性對比,并以cELISA為“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行符合率對比。同時(shí),對常規(guī)RBPT、改良RBPT 和cELISA 檢測結(jié)果不一致的樣品,采用SAT(微量法)進(jìn)行驗(yàn)證。
在239 份羊血清檢測中,用常規(guī)RBPT 檢出44 份非免疫場、55 份免疫場陽性血清,而用改良RBPT 分別檢出65、88 份。55 份陰性血清均為陰性(表1)。
表1 兩種RBPT 檢測羊血清樣品結(jié)果 單位:份
采用cELISA 檢測239 份羊血清,結(jié)果檢出61 份非免疫場、62 份免疫場陽性血清,55 份陰性血清全部為陰性(表2)。
表2 cELISA 試驗(yàn)檢測羊血清樣品結(jié)果 單位:份
在檢測非免疫場羊血清樣品時(shí),常規(guī)RBPT 的敏感性為68.85%(42/61),特異性為93.55%(29/31),與cELISA 的符合率為77.17%(71/92);在檢測免疫場羊血清樣品時(shí),敏感性為75.81%(47/62),特異性為73.33%(22/30),與cELISA 的符合率為75.00%(69/92)。
在檢測非免疫場羊血清樣品時(shí),改良RBPT的敏感性為91.80%(56/61),特異性為70.97%(22/31),與cELISA 的符合率為84.78%(78/92);在檢測免疫場羊血清樣品時(shí),敏感性為98.39%(61/62),特異性為10%(3/30),與cELISA 試驗(yàn)的符合率為69.57%(64/92)。
在檢測55 份陰性血清時(shí),兩種RBPT 和cELISA 檢測全部為陰性,符合率為100%。
對33 份常規(guī)RBPT 檢測為陰性,而改良RBPT 和cELISA 檢測均為陽性的樣品,采用SAT法(微量法)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果可疑的16 份,陽性的5 份(表3)。
表3 試管凝集試驗(yàn)對兩種檢測方法結(jié)果的驗(yàn)證 單位:份
20 世紀(jì)50 年代,布病曾在我國廣泛流行。隨著防控力度的不斷增強(qiáng),20 世紀(jì)80—90 年代,我國布病疫情降至歷史最低水平。然而,2000 年以來,隨著我國家畜飼養(yǎng)量不斷增加,動(dòng)物及其產(chǎn)品流通頻繁,部分地區(qū)布病暴發(fā)呈持續(xù)上升勢頭,嚴(yán)重威脅了畜牧業(yè)生產(chǎn)和人民群眾的身體健康。2013—2017 年,國家動(dòng)物布病參考實(shí)驗(yàn)室對有流產(chǎn)癥狀的布病非免疫牛場采集血清樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果布魯氏菌血清抗體平均個(gè)體陽性率高達(dá)44.2%[5]。
根據(jù)《國家布魯氏菌病防治計(jì)劃(2016—2020 年)》的相關(guān)要求,實(shí)驗(yàn)室檢測也是畜間布病防治的重要技術(shù)措施,縣級動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)具備開展布病血清學(xué)檢測能力,省級動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)能有效開展布病病原學(xué)檢測工作[1]。因此,家畜布病診斷技術(shù)研究對于布病防控具有重要意義。
本研究比較了常規(guī)RBPT 和改良RBPT 對羊血清樣品的檢測情況,同時(shí)按照我國現(xiàn)行動(dòng)物布病的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18646—2018),采用cELISA 和SAT 進(jìn)行確診,結(jié)果改良RBPT 比常規(guī)RBPT 多檢測出33 份cELISA 檢測陽性樣品,其中16 份經(jīng)SAT 判定為可疑,5 份判定為陽性,沒有出現(xiàn)RBPT 檢測為陰性而常規(guī)RBPT 檢測為陽性的樣品,說明改良RBPT 在檢測羊血清樣品時(shí)的敏感性要高于常規(guī)RBPT。因此,用改良RBPT 在存在陽性動(dòng)物的羊群中開展檢測,更容易篩選到抗體滴度較低的陽性動(dòng)物,從而減少漏檢率。
特異性方面,在檢測非免疫場和免疫場血清樣品時(shí),改良RBPT 都低于常規(guī)RBPT。值得注意的是,當(dāng)使用改良RBPT 檢測免疫場的羊血清樣品時(shí),該方法的特異性僅為10%,這與采用該方法對55 份陰性羊場的血清樣品檢測無假陽性出現(xiàn)的結(jié)果存在較大差異。對cELISA 試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析表明,27 份cELISA 檢測為陰性而改良RBPT 檢測為陽性的免疫場羊血清中,有19 份抑制率介于20%~30%。由于本研究免疫場的羊血清樣品為S2 疫苗注射免疫10 個(gè)月后所采集,此時(shí)大部分免疫羊的布病免疫抗體剛好降低到cELISA檢測臨界值之下(抑制率小于30%),所以采用cELISA 檢測時(shí)為陰性。
綜上所述,改良RBTP 的敏感性要高于常規(guī)RBPT,可以在陽性羊群中篩選到更多抗體效價(jià)較低的早期感染動(dòng)物。但改良RBTP 特異性有一定程度的降低,必須結(jié)合SAT、cELISA 等特異性高的方法進(jìn)行確診,以避免對假陽性動(dòng)物的“誤殺”。