高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒自然感染與人工感染下的組織病理學(xué)觀察

夏 陽，武 斌，尹燕博，張 毅，李吉達(dá)

（1.遵義醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院人畜共患病研究所，貴州遵義 563000；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 山東青島 266109；3.石家莊四藥有限公司，河北石家莊 050000）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起，是重要豬傳染病之一[1]。該病于1987 年首次報(bào)道于美國[2-3]，其后在加拿大、法國、德國、英國、荷蘭、比利時(shí)、西班牙、日本、菲律賓、澳大利亞等國家發(fā)生[4-6]。1996 年，郭寶清等[7]首次在流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSV，從而證實(shí)了我國也有PRRS 流行。2006 年，我國大范圍暴發(fā)了以豬群體溫高熱不退、皮膚發(fā)紅、呼吸困難為主要臨床癥狀的豬群疫情，最終確定是由PRRSV 變異株引起的。因其臨床發(fā)病率及致死率遠(yuǎn)高于以往，所以該次疫情被定名為高致病性PRRS（HP-PRRS）疫情[8-9]。此次HP-PRRS 疫情導(dǎo)致大量豬只死亡，給國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[10]。HP-PRRS 暴發(fā)以來，圍繞病毒致病力增強(qiáng)的原因及其機(jī)制，研究者從病原學(xué)角度做了大量工作[11-13]。然而，無論是針對非結(jié)構(gòu)區(qū)還是結(jié)構(gòu)蛋白的研究，目前有關(guān)HP-PRRSV 致病能力增強(qiáng)的原因及其機(jī)制仍未有明確的解釋。伴隨著國內(nèi)滅活疫苗及減毒疫苗的成功研制及應(yīng)用，HP-PRRS 疫情得到有效控制。然而由于過于忌憚HP-PRRS 的危害，疫苗尤其是減毒疫苗，存在濫用情況，使得國內(nèi)已經(jīng)很難找到PRRS 陰性豬場。研究[14-15]顯示，自2006 年HP-PRRS 暴發(fā)以來，國內(nèi)PRRS 分離株多屬于高致病性病毒（HP-PRRSV）的分支，且同源性極高。這些分離株是否有的來自于疫苗毒不得而知，但田間PRRSV 可能正面臨著新一輪的選擇壓力。因此，要想從根本上解除PRRS 的威脅，對于PRRSV 致病機(jī)制的研究刻不容緩。

目前，對于HP-PRRSV的病理學(xué)研究報(bào)道很多，但大都針對臨床發(fā)病病例，而對于人工感染的HPPRRS 病例病理學(xué)研究鮮有報(bào)道，因而對于宿主各組織的病理性損傷，很難從致病機(jī)理方面做出準(zhǔn)確判斷。基于此，本研究擬對HP-PRRSV 自然感染發(fā)病組和人工感染發(fā)病組進(jìn)行病理組織學(xué)比較觀察，以期為PRRSV 的致病機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

PRRSV JXA1 株（TCID50為10-5.67），購自中國動物疫病預(yù)防控制中心；自然發(fā)病組病料，采自全國各地發(fā)病豬場；人工感染發(fā)病組病料，采自JXA1 株試驗(yàn)組；15 頭PRRSV 抗體、抗原雙陰性1 月齡仔豬，購自山東省青島市某豬場。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與飼養(yǎng) 采集全國各地發(fā)病并已鑒定為HP-PRRSV 感染的病豬，標(biāo)記為自然發(fā)病組；隨機(jī)挑選PRRSV 抗體、抗原雙陰性1 月齡仔豬10 頭，頸部肌內(nèi)注射PRRSV 細(xì)胞毒（TCID50為10-5.67）2 mL；將5頭1 月齡仔豬設(shè)立為陰性對照組，頸部肌內(nèi)注射滅菌生理鹽水2 mL。所有仔豬均在SPF 動物房中飼養(yǎng)，攻毒試驗(yàn)組與陰性對照組分別在安檢區(qū)與效檢區(qū)喂養(yǎng)，日常飲水、飼料一致。

1.2.2 大體病例解剖學(xué)觀察 剖檢病死豬（包括自然感染和人工感染），觀察病變并拍照，分別摘取肺、淋巴結(jié)、脾、腦、心臟、腎、膀胱、肝、胃、腸、氣管、喉頭等，肉眼觀察各組織器官病變。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察 快速采集肺、淋巴結(jié)、扁桃體、脾、腦、心臟、腎、肝、腸、氣管、心血管等病料，用10%福爾馬林固定后，制作常規(guī)石蠟切片，HE 染色，然后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，在顯微鏡下觀察病變并拍照。

2 結(jié)果

2.1 自然感染發(fā)病豬病理剖檢

自然感染發(fā)病豬臨床上主要表現(xiàn)為精神沉郁、嗜睡、高熱、耳尖發(fā)紺（圖1-A、1-B）。發(fā)病豬解剖后大體病理學(xué)變化（圖中紅色箭頭所示）主要表現(xiàn)為：肺部水腫，彌漫性出血（圖1-C）；腸黏膜面出血，部分病例見“扣狀腫”（圖1-D）；肝臟表面常見灰白色壞死灶（圖1-E）；全身淋巴結(jié)出血嚴(yán)重（圖1-F）；部分病例胃底部黏膜見片狀出血（圖1-G）；絕大多數(shù)病例心基部見噴灑樣出血點(diǎn)（圖1-H）；脾臟不同程度腫大（圖1-I）；氣管喉頭黏膜面出血（圖1-J）；常見“僵豬”腹部臟器粘連（圖1-K）；腎臟不同程度水腫，揭開被膜，見針尖大小出血點(diǎn)（圖1-L）。

2.2 人工感染發(fā)病豬病理剖檢

人工感染發(fā)病豬臨床癥狀及病理剖檢（圖中紅色箭頭所示）主要表現(xiàn)為：高熱、嗜睡（圖2-a），犬坐、腹式呼吸（圖2-b），肺組織間質(zhì)水腫、出血（圖2-c），脾臟腫大（圖2-d），扁桃體出血（圖2-e），肝臟腫脹（圖2-f），腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血（圖2-g），氣管黏膜出血（圖2-h），腦部水腫（圖2-i），腎臟腫大、變形（圖2-j）。

2.3 自然感染發(fā)病豬病理組織學(xué)觀察

自然感染發(fā)病豬病理組織學(xué)變化如下（紅色箭頭指示主要病變）：肺泡相互融合、“氣球樣”變，肺間質(zhì)增寬，間質(zhì)內(nèi)見大量單核細(xì)胞（圖3-A）；肺泡壁出血，血漿析出，肺泡內(nèi)見透明膜形成，肺小動脈充血（圖3-B）；氣管黏膜下水腫（圖3-C）；腎小管出血，上皮細(xì)胞見水泡樣變形（圖3-D）；肝細(xì)胞見水泡變形、顆粒變性、脂肪變性，肝血竇充血，肝細(xì)胞壞死，局部形成壞死灶（圖3-E、3-F）；脾臟見淋巴小結(jié)增生、脾小梁結(jié)締組織壞死、玻璃樣變性（圖3-G、3-H）；腸絨毛斷裂、脫落（圖3-I）；腸集合淋巴小結(jié)增生（圖3-J）；腦組織見小膠質(zhì)細(xì)胞增多和“管套”現(xiàn)象（圖3-K）。

2.4 人工感染發(fā)病豬病理組織學(xué)觀察

圖1 自然感染發(fā)病豬臨床癥狀及大體病理解剖學(xué)變化

圖2 人工感染發(fā)病豬臨床癥狀及大體病理解剖學(xué)變化

圖3 自然感染發(fā)病豬病理組織學(xué)觀察結(jié)果

人工感染發(fā)病豬病理組織學(xué)變化（紅色箭頭指示主要病變）如下：肺泡相互融合、“氣球樣”變，肺泡壁增厚、肺間質(zhì)增寬，肺泡壁出血、血漿析出，肺泡內(nèi)見透明膜形成，血管周圍間隙增寬，有水腫液析出（圖4-a）；動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死、脫落（圖4-b）；腎臟小靜脈周圍間隙增寬（圖4-c）；肝中央靜脈淤血，蛋白樣析出（圖4-d）；肝細(xì)胞見脂肪變性（圖4-e）；腎小球明顯腫脹，腎小囊腔變窄（圖4-f）；腎小管周圍見炎性細(xì)胞浸潤（圖4-g）；腦神經(jīng)元細(xì)胞大量壞死，呈現(xiàn)“篩網(wǎng)狀”變化（圖4-h）；小膠質(zhì)細(xì)胞局灶性增多，出現(xiàn)嗜神經(jīng)元現(xiàn)象（圖4-i、4-j）；腦血管周圍炎性細(xì)胞浸潤，“管套”現(xiàn)象明顯（圖4-k）；脾淋巴小結(jié)增生，小梁結(jié)構(gòu)紊亂，脾臟結(jié)締組織增生（圖4-l—圖4-q）；氣管黏膜層炎性細(xì)胞浸潤、水腫（圖4-r）；心肌纖維水腫，肥大細(xì)胞浸潤（圖4-s）；扁桃體出血，隱窩內(nèi)細(xì)胞壞死（圖4-t、4-u）。

3 討論

3.1 PRRSV 及HP-PRRSV 病理學(xué)研究

受毒株[17-18]、免疫狀態(tài)[19]以及管理因素影響[20]，豬群感染PRRSV 后，臨床表現(xiàn)復(fù)雜。早期臨床癥狀見結(jié)膜炎、精神沉郁、嗜睡、食欲減退，通常持續(xù)幾天至兩周左右；中后期則表現(xiàn)為呼吸困難，體溫居高不下，肢體末端開始淤血，并伴有神經(jīng)癥狀。趙德明等[21]對感染PRRSV 的仔豬進(jìn)行病理組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：大體病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為肌肉灰白色變化、淺表血管輕度淤血；病理組織學(xué)變化則表現(xiàn)為典型的間質(zhì)性肺炎，包括肺水腫、間質(zhì)增寬及炎性細(xì)胞浸潤。2006 年，我國大范圍內(nèi)暴發(fā)了以體溫高熱不退、皮膚發(fā)紅、呼吸困難為主要臨床癥狀的PRRS 疫情。研究[8，22-23]發(fā)現(xiàn)，該病是PRRSV 變異株（JXA1 株）引起的，且該毒株業(yè)內(nèi)公認(rèn)是HP-PRRSV。隨后該病引起業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注，大量研究見之于刊。其中病理學(xué)方面的研究大多針對臨床自然發(fā)病病例，而對于人工感染方面鮮有報(bào)道。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，只有劉佩紅等[24]針對HP-PRRSV 感染后的肺臟病理組織學(xué)變化進(jìn)行了報(bào)道。由于宿主各組織的病理性損傷很難從致病機(jī)理方面做出準(zhǔn)確判斷，因此本研究對HP-PRRSV 自然感染發(fā)病組和人工感染發(fā)病組進(jìn)行病理組織學(xué)比較觀察，可為PRRSV 的致病機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

3.2 人工感染和自然感染的病理學(xué)變化

本研究通過對自然和人工感染HP-PRRSV 病例進(jìn)行比較病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：（1）從病變的嚴(yán)重程度看，自然環(huán)境中的臨床病例要高于單純的HPPRRSV 感染。以淋巴組織為例，自然條件下病變幾乎遍布所有淋巴結(jié)，而人工感染情況下病變明顯者僅見于肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)以及下頜淋巴結(jié)。（2）從癥狀種類來看，自然環(huán)境中的臨床病例往往是多種疾病典型癥狀同時(shí)出現(xiàn)，如“扣狀腫”“麻雀腎”（豬瘟的典型臨床表現(xiàn)），肝臟部位灰白色壞死灶（副傷寒癥狀之一）；相比之下，人工感染情況下，腸道及腎臟的病變就沒有那么明顯。此外，繼發(fā)感染尤其是繼發(fā)細(xì)菌感染現(xiàn)象在自然發(fā)病的臨床病例中極為常見。（3）肺部病理學(xué)變化對于PRRS 以及HP-PRRS 診斷具有指證意義。自然和人工感染病例在肺臟上均表現(xiàn)為嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎。不同的是，自然發(fā)病病例在混合感染豬流感病毒時(shí)，肺臟表面會出現(xiàn)彌散性出血點(diǎn)，而人工感染情況下尚未見到。本研究中的自然病例病理學(xué)變化與劉思當(dāng)?shù)萚25]的報(bào)道一致?；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn)及現(xiàn)有報(bào)道，本研究認(rèn)為單純的HP-PRRSV 感染所引起的病理變化主要表現(xiàn)為：以肺水腫、肺間質(zhì)增寬、炎性細(xì)胞浸潤為主要表觀的嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎癥狀，下頜、肺門及腸系膜淋巴結(jié)出血，其中肺部病變對該病的診斷具有指證意義。

3.3 病理變化對HP-PRRSV 致病機(jī)制的推導(dǎo)

圖4 人工感染發(fā)病豬病理組織學(xué)檢查結(jié)果

肺臟作為PRRSV 的原發(fā)性器管，在病毒感染過程中首當(dāng)其沖，其中肺泡巨噬細(xì)胞（pulmonarg alvcolar macrophages，PAMs）為病毒攻擊的首要靶細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病動物免疫器官（淋巴結(jié)與脾臟尤為明顯）以及血液循環(huán)系統(tǒng)的變化，對于HP-PRRSV 致病機(jī)制的推演具有線索意義。大體病理學(xué)及病理組織學(xué)變化觀察結(jié)果均顯示，淋巴結(jié)與脾臟病變明顯?；诂F(xiàn)有的研究證據(jù)，推測PRRSV 與PAMs 細(xì)胞表面受體結(jié)合以后，以胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞，伴隨著病毒的大量復(fù)制、PAMs 壞死、崩解，病毒粒子經(jīng)淋巴循環(huán)到達(dá)以淋巴結(jié)和脾臟為主的外周免疫器官，并引起免疫器官損傷（淋巴結(jié)出血、脾臟結(jié)構(gòu)紊亂）。在這種情況下，機(jī)體免疫力大大降低，這增加了自然條件下繼發(fā)其他病原感染的概率。該結(jié)論也同樣出現(xiàn)在Liu 等[16]的報(bào)道中。本研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)臟器部位的血管表現(xiàn)出一致的病理變化：血管間隙因水腫液的析出而增寬并伴隨炎性細(xì)胞浸潤。與此同時(shí)，剖檢過程中發(fā)現(xiàn)，病死動物右心衰竭非常普遍?；谝陨习l(fā)現(xiàn)推測，HP-PRRSV 對循環(huán)系統(tǒng)形成了攻擊（PRRSV能夠引起病毒血癥已被廣泛證實(shí)），其攻擊的靶細(xì)胞很可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，圖4-c），動脈炎由此發(fā)生，血管內(nèi)呈高壓狀態(tài)。伴隨著肺動脈高壓的加劇，肺循化受阻，右心室代償性肥大，其他臟器牽連受損，其中以腦和腎臟病變表現(xiàn)最為明顯。