巨菌草根部促生菌的篩選及其促生效應(yīng)

鄧振山 陳凱凱 李靜 劉顯春 張寶寶 張寶成

摘 要：為進一步開發(fā)植物促生菌，該研究以巨菌草根部為主要材料進行巨菌草促生菌的篩選，采用解磷、固氮和產(chǎn)IAA等篩選標(biāo)準(zhǔn)對初篩菌株分別進行多項促生能力的測定。通過形態(tài)觀察、生理生化特性和 16S rDNA序列同源性分析對促生效果最好的菌株YB-07進行分類和鑒定，分別測定其促生能力后從中篩選出促生效應(yīng)強的11個菌株進行盆栽試驗，并通過對這些菌株單獨回接和多菌混接的小麥盆栽試驗測定其對小麥的促生效應(yīng)。結(jié)果表明：從巨菌草根部分離得到了101株促生菌株，分類鑒定結(jié)果顯示菌株YB-07歸屬于根瘤菌屬（Rhizobium），其溶磷量為20.1 mg·L-1、產(chǎn)IAA量為23.7 mg·L-1，同時具有產(chǎn)氨能力。盆栽試驗測定結(jié)果顯示，多菌混合接種對小麥的促生效應(yīng)在株高、干重、鮮重和葉綠素含量上，分別較對照組增加了24.49%、31.84%、28.06%和34.14%。單菌接種對小麥的促生表現(xiàn)在株高、干重、鮮重和葉綠素含量上，分別較對照組增加了13.54%、20.45%、16.84%和35.19%。所篩選到的菌株具有良好的促生長作用，能為進一步構(gòu)建巨菌草促生菌菌群提供良好的種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞：巨菌草，促生菌，篩選，促生效應(yīng)，盆栽試驗

中圖分類號：Q939.95

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）09-1323-09

Abstract：

In this study，the root of the Pennisetum sinese was used as the main research material，screening of growth-promoting strains from P. sinese，and explore the growth-promoting effects of growth-promoting strains. We used the following screening criteria for the determination of multiple growth-promoting capacities of primary strains：the ability to solubilize phosphorus，the ability to fix nitrogen，the ability to produce IAA. The strain YB-07 with the best growth-promoting effect was classified and identified through physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence homology analysis. Eleven strains with better overall performance were screened out and used for a pot experiment with a single inoculation and multi-microbe mixed inoculation to determine its growth-promoting effect. A total of 101 strains were isolated from the roots of the P. sinese，and the growth-promoting ability was measured. Among them，the strain with excellent overall performance was YB-07，which had a phosphorus content of 20.1 mg·L-1，an IAA yield of 23.7 mg·L-1，and an ability to produce ammonia at the same time. The results of pot experiment showed that the effect of multi-microbe mixed inoculation on wheat growth increased by 24.49%，31.84%，28.06% and 34.14% in the height，dry weight，fresh weight and chlorophyll content，respectively. Single bacterium inoculation increased the plant height，dry weight，fresh weight，and chlorophyll content by 13.54%，20.45%，16.84% and 35.19%，respectively，compared with the control group. The selected strain has good growth-promoting effect，can provide a good seed resources for the further construction of the P. sinese flora promoting bacteria.

Key words：Pennisetum sinese，promoting bacteria，screening，growth-promoting effect，pot experiment

巨菌草（Pennisetum sinese）隸屬于禾本科狼尾草屬，多年生，適宜在熱帶、亞熱帶、溫帶生長和人工栽培。巨菌草是2005年—2007年間由福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所在南非引進的品種，因其在當(dāng)?shù)厣L時植株特別高大，所以將其暫命名為巨菌草，后經(jīng)鑒定其與國內(nèi)其他狼尾草略有差別，現(xiàn)正在申報新品種認(rèn)定。巨菌草屬于典型的C4植物，其植株高大，株高一般為3～5 m，抗逆性強，產(chǎn)量高，粗蛋白和糖分含量高（林興生等，2013）。植物內(nèi)生菌在現(xiàn)今植物微生物學(xué)、微生物學(xué)應(yīng)用研究領(lǐng)域中已占據(jù)越來越重要的位置，主要歸功于其具有很多有益的生物學(xué)特性，如內(nèi)生細(xì)菌具有增加宿主溶磷（王麗萍等，2015）、分泌吲哚乙酸（IAA）（羅菲等，2011）、固氮（Webster et al.，1997）等促進植物生長的作用。目前，巨菌草已用于香茹、黑木耳等多種食用藥用菌的栽培（王麗萍等，2015），但對巨菌草的研究大多集中在抗寒、抗堿、抗鹽、抗旱等方面（林興生等，2013;王麗萍等，2015）。

自在延安地區(qū)實施“退耕還林還草工程”以來，采取封山育林措施，將畜牧業(yè)養(yǎng)殖模式由傳統(tǒng)的“散養(yǎng)型”改為“圈養(yǎng)型”，從而導(dǎo)致飼草短缺成為了制約延安地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的瓶頸。為解決飼草短缺、成本高以及“治溝造地工程”土壤改良的問題，2012年延安大學(xué)科研人員從國家菌草工程研究中心成功引種巨菌草到延安市，經(jīng)過多年的試驗和示范，已成功推廣了2 000 hm2，促進了當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的發(fā)展。然而，關(guān)于巨菌草內(nèi)生菌的相關(guān)研究目前很少見有報道。本研究以巨菌草為材料，從中篩選出具有促生效應(yīng)的內(nèi)生細(xì)菌菌株，并采用單菌接種和多菌混合接種的方法，根據(jù)盆栽試驗結(jié)果，測定所篩選菌株的促生效應(yīng)，以期為進一步開發(fā)植物促生菌提供種質(zhì)資源以及延安地區(qū)巨菌草高效規(guī)范化管理與示范推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 巨菌草根部樣品的采集及前期處理? 巨菌草根部樣品從延安大學(xué)翠園巨菌草示范基地采集，用五點采樣法，選擇生長性狀良好、無病害癥狀的健康巨菌草植株體根部樣品80個，用滅菌袋包裝帶回實驗室。4 ℃低溫保藏，48 h內(nèi)處理完。

1.1.2 盆栽試驗土壤來源及處理? 用于盆栽試驗的土壤采自延安大學(xué)的后山，采集完成后，滅菌袋裝好帶回實驗室。用篩子（5 mm）篩除土壤中大顆粒的土壤、沙石、植物根和未完全腐爛的落葉、枝條等雜質(zhì)。處理后的土壤裝入塑料盆中待用（塑料盆直徑12 cm），每盆裝入土壤1.5 kg，待用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母膏5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.0。（2）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。（3）阿須貝（Ashby）培養(yǎng)基：葡萄糖或甘露醇10.0 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO3 5.0 g，瓊脂15～20 g，H2O 1 000 mL，pH7.0。（4）解磷細(xì)菌培養(yǎng)基：NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，（NH4）2SO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，蔗糖 10 g，瓊脂 15～20 g，H2O 1 000 mL，pH7.0～7.5。（5）NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蔗糖10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。（6）產(chǎn)IAA培養(yǎng)基：KH2PO4 0.5 g，酵母膏1 g，甘露醇10 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 0.1 g，色氨酸100 mg，蒸餾水1 000 mL，pH6.8～7.2。

1.2 方法

1.2.1 樣品的表面消毒 首先將巨菌草根部用自來水將附著在根部樣品表面的殘留土沖洗干凈，用吸水紙吸干根部表面的水。接著將根部樣品浸泡在濃度為75%的乙醇中，浸泡2～3 min，無菌ddH2O沖洗3次，滅菌的吸水紙吸干后，將根部樣品浸泡在濃度為0.1%的 HgCl2 溶液中，浸泡時間為3 min，取出立即用無菌ddH2O沖洗6次，確保消毒劑的無殘留。最后將最后一次沖洗的無菌ddH2O涂布到同樣的培養(yǎng)基上用于檢測根部樣品的表面消毒是否徹底（王志勇和劉秀娟，2014）。

1.2.2 促生菌株篩選 將表面消毒徹底的巨菌草根部樣品截成約1 cm的小段，將根段放入篩選培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基包括PDA培養(yǎng)基、產(chǎn)IAA培養(yǎng)基、Ashby培養(yǎng)基和解磷培養(yǎng)基等），于（28±1）℃恒溫靜置培養(yǎng)3～5 d。待培養(yǎng)基中有可見菌落時，挑取周圍菌落移入相應(yīng)培養(yǎng)基純化，并進行菌落形態(tài)描述、編號和置于4 ℃冰箱中備用。將最后一次沖洗的無菌水涂布于培養(yǎng)基上作為對照，于恒溫靜置培養(yǎng)，檢驗表面消毒是否徹底。

1.3 促生能力的測定

1.3.1 紫外分光光度計法測定吲哚乙酸含量 將篩選獲得的菌株接入PDA培養(yǎng)基中，在180 r·min-1、28 ℃的條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后各取3 mL的菌液，10 000 r·min-1離心8 min，取離心好的上清液1 mL，并加入2 mL的Salkowskis （10.8 mol·L-1 H2SO4含 4.5 g 的FeCl3）反應(yīng)液。在暗處靜置混合反應(yīng) 30 min。測定OD540 nm的值，使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將測得的數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得產(chǎn)吲哚乙酸的含量。用去離子水作為對照處理（田宏等，2005）。

1.3.2 鉬藍(lán)比色法測定處理液中的磷含量 分別取配置好的 50 μg·mL-1的含磷標(biāo)準(zhǔn)液各0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分別置于20 mL具塞試管中，分別先加蒸餾水至 6 mL，再加入1 moL·L-1的硫酸溶液2 mL、2 mL鐵鉬酸試劑，混勻。靜置 15 min以后，用比色皿在分光光度計OD660 nm波長處測定吸光度。用所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的吸光度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算待測樣品溶液的磷含量（張祥勝，2008）。

1.3.3 產(chǎn)氨能力的測定 將待測菌株接種到NA培養(yǎng)基中，置于180 r·min-1、28 ℃的條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取100 μL/5 mL 接種于阿須貝液體培養(yǎng)基中，以接種無菌水為對照，每處理3個重復(fù)，置于 28 ℃ 恒溫下培養(yǎng)，7 d 后觀察對比試驗組與對照組的渾濁情況，明顯渾濁的為陽性，即為有固氮活性（王娜娜，2010;Zahoor et al.，2017）。另將待測菌株接入蛋白胨（10 g·L-1）培養(yǎng)液的試管中，加入0.5 mL Nesslers試劑，出現(xiàn)黃褐色沉淀的為產(chǎn)NH3陽性反應(yīng)（王剛等，2009）。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 培養(yǎng)特征的觀察 將菌株YB-07采用平板劃線法接種于NA培養(yǎng)基中，28 ℃ 培養(yǎng)1～2 d，觀察并記錄單菌落特征。

1.4.2 生理生化鑒定 將菌株YB-07進行革蘭氏染色、甲基紅測定、V-P測定、淀粉水解、吲哚試驗、油脂水解和明膠水解試驗。試驗測定及初步鑒定參考《微生物學(xué)實驗》的方法（蔡信之和黃君紅，2010）。

1.4.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 測定初篩菌的促生能力后，選擇具有多種促生效應(yīng)的優(yōu)勢菌株YB-07進行鑒定。對菌株YB-07 16S rDNA基因片段進行PCR擴增和測序，獲得GenBank登錄號后，運用MEGA 6.06 軟件，選用鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征（張磊等，2017;張苗苗等，2017）。

1.5 盆栽試驗

1.5.1 小麥種子處理 采用小麥（品種為陜優(yōu)225號）進行盆栽試驗，將陜優(yōu)225小麥種子先用冷水預(yù)浸泡4～6? h，撈出后再用52～55 ℃溫水浸泡1～2 min，使種子溫度達到 50 ℃，撈出后放入56 ℃ 溫水中，浸泡5 min取出，用涼水冷卻后晾干播種。

1.5.2 促生菌株間親和性測試 采用劃線接種的方法測試菌株之間是否存在拮抗作用。將待測的促生菌株分別兩兩交叉接種于PDA培養(yǎng)基上，放入恒溫箱中，28 ℃培養(yǎng) 2～3 d。若兩兩交叉劃線處菌株能夠正常生長，則菌株間無拮抗作用，說明可以制作復(fù)合菌懸液進行試驗。

1.5.3 接種菌劑的制備 將選取的促生菌菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、180 r·min-1的條件下培養(yǎng)48 h。各取培養(yǎng)物裝入3 mL 離心管中，10 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入生理鹽水1 mL制備成菌懸液，并按表1的設(shè)計方法（多菌混合組，包括：固氮、溶磷混合組;溶磷、產(chǎn)IAA混合組;固氮、溶磷與產(chǎn)IAA混合組）處理后，分別取1.2 mL（2.0×109 個·mL-1）接種于滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r·min-1下培養(yǎng)2～3 d，可獲得菌株接種劑。

1.2 mL無菌水

1.2 mL sterile water

1.5.4 接種處理 每次選取 5 粒飽滿、大小均勻的小麥種子進行播種，5個播種點均勻分布，種子離土表面 3～5 cm。每個處理設(shè) 3 個重復(fù)，自然光照下培養(yǎng)。在種子催芽過程中，每周每個處理每次接種濃度為2.0×109 個·mL-1的菌懸液1.2 mL，同時對照組接種等量的無菌水，土壤濕度保持為60%。15 d后測定小麥苗子的株高、根長、鮮重、葉綠素含量等指標(biāo)，并做統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

用多種不同的培養(yǎng)基，從巨菌草根部樣品中經(jīng)分離、純化共獲得 101株菌株，分別測定促生能力后，從中篩選出促生效果好的11株菌株進行后續(xù)的促生試驗。其中有8株具有產(chǎn)氨能力，6株具有溶磷能力，3株具有產(chǎn)IAA能力（表2）。

2.2 促生能力的測定

通過試驗分別測定了11株促生能力較強菌株的促生指標(biāo)，其結(jié)果見表3。從表3可以看出，菌株YB-07同時具有產(chǎn)氨能力、產(chǎn)IAA和溶磷三種促生能力;菌株NP-01的溶磷量最高，溶磷量為45.1 mg·L-1;具有產(chǎn)IAA能力的三株菌IAA產(chǎn)生能力相差不大，其中菌株N-01產(chǎn)量最大（達到了26.5 mg·L-1）菌株YB-07同時具有產(chǎn)氨能力、產(chǎn)IAA和溶磷三種促生能力，因此本文選取該菌株作為代表菌株進行后續(xù)研究。

2.3 促生菌株間親和性測試

菌株N-02與NP-01、N-01、N-02與NP-01及菌株YB-07、YB-08、YB-09與YB-10兩兩劃線交叉處均有菌株生長，表明這些菌株間無拮抗作用，可以用作混合菌劑的制備。

2.4 菌株YB-07的鑒定

2.4.1 培養(yǎng)特征觀察 將觀察菌株YB-07在NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后形成的菌落，形狀近圓形，粘稠狀，半透明，邊緣整齊，表面稍凸起而富有光澤（圖1）。

2.4.2 生理生化特征 菌株YB-07的生理生化測定結(jié)果如表4所示。

2.4.3 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 經(jīng)NCBI的Blast比對結(jié)果顯示，菌株YB-07與根瘤菌屬（Rhizobium）的相似度為99.67%，因此歸屬于根瘤菌屬（Rhizobium），其GenBank登錄號為KY852244，其系統(tǒng)進化樹如圖2所示。

2.5 盆栽試驗的結(jié)果

小麥在培養(yǎng)15 d后，對進行不同處理的小麥各種形態(tài)學(xué)參數(shù)進行測量（表5）。由表5可知，除個別外（如在葉綠素含量上處理N3高于處理PY），總體而言，從小麥促生效應(yīng)的表現(xiàn)結(jié)果上看，在株高、根長、干重和鮮重上，多菌混合接種明顯優(yōu)于單菌接種，其中處理N+P與多菌混合組PY、NPY和N+P與單菌接種組各處理之間差異顯著（P<0.05）。單菌接種與多菌混合接種各處理組均高于對照組，差異顯著（P<0.05）。在株高上，單菌接種與對照組相比較分別增加了8.13%、13.54%、16.04%、22.61%、31.06%和31.69%，差異顯著（P<0.05）。多菌混合接種與對照組相比增加幅度為21.08%～40.46%（分別為40.76%、21.08%和24.49%），差異顯著（P<0.05）。在干重上，單菌接種與對照組相比增加幅度為10.20%～41.33%（分別為16.84%、10.20%、10.20%、41.33%、1990%和11.22%），差異顯著（P<0.05）。多菌混合接種與對照組相比增加幅度為28.06%～5255%（分別為28.06%、28.06%和52.55%），差異顯著（P<0.05）。在鮮重上，單菌接種與對照組相比增加幅度為18.18%～27.27%（分別為22.73%、0、18.18%、20.45%、27.27%和18.18%），差異顯著（P<0.05）。多菌混合接種與對照組相比增加幅度為20.45%～65.91%（分別為65.91%、31.81%和20.45%），差異顯著（P<0.05）。在葉綠素含量這一參數(shù)上，單菌接種與對照組相比較增加幅度為16.13%～35.19%（分別為28.49%、16.13%、27.43%、34.84%、35.19%和26.16%），差異顯著（P<0.05）。多菌混合接種與對照組相比增加幅度為17.19%～34.14%（分別為34.14%、27.96%和17.19%），差異顯著（P<0.05）。從總體來看，單菌接種與多菌混合接種均對小麥生長有一定的促生效果，多菌混合接種明顯優(yōu)于單菌接種對小麥的促生效應(yīng)。但從某些促生效果來看，單菌接種的效果卻高于多菌混合接種，如菌株N3接種過后的小麥葉綠素含量增加了38.0%，而處理PY混合接種的葉綠素含量才增加了36.2%，其他指標(biāo)也有類似結(jié)果，其各項促生指標(biāo)均高于其他單菌接種處理組的效果，差異顯著（P<0.05）。小麥促生長狀況如圖3所示。

3 討論與結(jié)論

本研究從巨菌草根部樣品中篩選出了11株促生能力較強的菌株，發(fā)現(xiàn)具有溶磷能力的有6株，產(chǎn)IAA的有3株。通過盆栽試驗表明，IAA產(chǎn)生量、溶磷能力對小麥的株高、根長、鮮重、干重和葉綠素含量等有明顯的促生效應(yīng)。小麥的生長指標(biāo)（株高、根長、鮮重、干重等）與促生菌的產(chǎn)氨能力、溶磷能力、產(chǎn)IAA能力之間呈正相關(guān)關(guān)系。這表明通過接種促生菌株來提高植物的生物量是一個非常有效的途徑，對農(nóng)業(yè)實際生產(chǎn)具有積極作用。

內(nèi)生細(xì)菌通過解磷（Paul & Sundararao，1997）、分泌植物激素（羅菲等，2011）、促進植物對礦質(zhì)元素的吸收（史應(yīng)武，2005）等途徑促進植物生長。關(guān)于促生菌株在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果已有文獻報道，如鄧振山等（2012）的研究結(jié)果表明在株高、根長和干重方面與對照組的比較分別增加了30.14%、81.10%和33.33%;常慧萍等（2016）分別用HN1202、HP1218、HK1216菌液對小麥種子進行浸種處理，小麥幼苗根長分別較對照（無菌液處理）顯著增加12.6%、20.4%、17.5%，株高分別較對照顯著增加11.8%、13.2%、8.8%;朱培淼等（2007）的研究結(jié)果表明在株高和鮮重方面與對照組比較分別增加了33.7%和97.7%。本研究中，通過盆栽試驗對篩選到的11株促生菌株進行促生能力測定，結(jié)果顯示多菌混合接種對小麥的促生效應(yīng)在株高、干重、鮮重和葉綠素含量上較對照組分別增加了24.49%、31.84%、28.06%和34.14%。從總體上來看，多菌混合接種明顯優(yōu)于單菌接種對小麥的促生效應(yīng)，混合菌株中各菌株間通過協(xié)同作用充分發(fā)揮其促生效果，此結(jié)果與?；燮嫉龋?016）和朱培淼等（2007）的結(jié)果一致。但單從某些方面來看，存在單菌接種的促生效果要高于多菌接種，發(fā)生這種現(xiàn)象的可能原因是由于多菌混合后產(chǎn)生了某種物質(zhì)，從而抑制了菌株產(chǎn)生的促生長因子發(fā)生效應(yīng)。當(dāng)然，影響內(nèi)生菌促進小麥生長的因素是比較復(fù)雜的，既有溶磷、分泌IAA，也有固氮、吸收營養(yǎng)物質(zhì)、分泌維生素、赤霉素、細(xì)胞分裂素等因素的影響，以及各個因素間的相互影響（龐發(fā)虎等，2016）。本研究篩選得到的菌株具有多種促生能力（包括固氮、產(chǎn)IAA和溶磷等），通過盆栽試驗證實菌株N-01、N-02、YB-07和P-03對小麥的促生效果顯著，但還需在田間對各菌株的定殖能力、促生能力和復(fù)合菌株中的優(yōu)勢促生菌進一步驗證與探究。此外，單菌接種的促生效果低于多菌混合接種的促生效果，在這些菌株的應(yīng)用過程中如何進行科學(xué)、合理地組合進而在大田試驗中發(fā)揮出更好的效果，尚需進一步研究。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）