miR-181及miR-146家族在不同甲狀腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及與BRAFV600E基因突變的關(guān)系

田延鋒，李 芳，張 杰，胡毅平，劉 擘，姜 霞，李冬蘊(yùn)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。大量研究表明，miRNA能扮演癌基因或抑癌基因的角色，其表達(dá)失調(diào)在腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[1]，其在甲狀腺癌中的研究也受到關(guān)注。既往研究表明，miR-146b及miR-181均與甲狀腺癌患者的BRAF基因突變有關(guān)[2]，但miR-146b及miR-181家族其他成員的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法，以U6為內(nèi)參，通過檢測不同甲狀腺癌細(xì)胞中miR-146及miR-181家族各成員的表達(dá)及與BRAFV600E突變的相關(guān)性，初步探討miR-146及miR-181家族各成員在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及對甲狀腺癌早期診斷及預(yù)后判斷的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與培養(yǎng)：甲狀腺癌細(xì)胞株BCPAP細(xì)胞(BRAFV600E基因突變)購于廣州吉妮歐生物科技有限公司，甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1細(xì)胞(無BRAFV600E基因突變)購于上海銳賽生物技術(shù)有限公司。2種細(xì)胞的培養(yǎng)條件：DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，1% P/S，1% GLn，37℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，貼壁生長及傳代培養(yǎng)以用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑與設(shè)備：提取miRNA的Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒，所用內(nèi)參U6、miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的引物均購自廣州復(fù)能基因有限公司。U6引物序列：5'-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3'；miR-146a引物序列：5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGUU-3'；miR-146b引物序列：5'-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCUG-3'；miR-181a引物序列：5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3'；miR-181b引物序列：5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3'；miR-181c引物序列：5'-AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU-3'；miR-181d引物序列：5'-AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU-3'。7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1RNA提?。焊鶕?jù)Trizol使用說明書提取組織總RNA后，分光光度計(jì)檢測RNA的濃度及A260/A280的數(shù)值，結(jié)果A260/A280>1.8。

1.2.2miR-146和miR-181表達(dá)檢測：采用qRT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收樣，棄培養(yǎng)基加入Trizol裂解液1 ml，按Trizol法提取總RNA，測量總RNA濃度。取總RNA 1 μl，2.5 U/μl Poly A Polymerase 1 μl，5×PAP/RT Buffer 5 μl，RTase Mix 1 μl，加ddH2O(RNase/DNase free)至25 μl配制成逆轉(zhuǎn)錄體系，按照All-in-oneTM miRNA First-Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)溫度：37℃，60 min，85℃，5 min，4℃保存?zhèn)溆谩０凑誂ll-in-oneTM miRNA qPCR Primers試劑盒操作說明檢測miR-181及miR-146家族各成員在細(xì)胞中的表達(dá)量，以U6作內(nèi)參，以2-ΔΔCt值計(jì)算各組細(xì)胞中miR-181及miR-146家族各成員的相對表達(dá)量。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以U6作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對定量法，以n=2-ΔCt表示標(biāo)本中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d的相對表達(dá)量，其中ΔCt=CtmiR-146/181-CtU6。

2 結(jié)果

2.1TPC-1和BCPAP細(xì)胞中miR-181和miR-146家族各成員的相對表達(dá)量 miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d在TPC-1和BCPAP細(xì)胞中的相對表達(dá)量見表1。

表1 TPC-1及BCPAP細(xì)胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d的表達(dá)情況

2.2miR-181和miR-146家族各成員的表達(dá)與BRAFV600E基因突變的關(guān)系 miR-146a、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d在BRAFV600E基因突變細(xì)胞株BCPAP中的表達(dá)量較無BRAFV600E基因突變細(xì)胞株TPC-1明顯增高(P<0.01)。而miR-146b在BRAFV600E基因突變細(xì)胞株BCPAP中的表達(dá)量較無BRAFV600E基因突變細(xì)胞株TPC-1明顯減低(P<0.01)。見表2和圖1。

圖1 miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d在TPC-1及BCPAP細(xì)胞中的表達(dá)量比較

表2 TPC-1與BCPAP細(xì)胞中miR-146a、miR-146b、miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d表達(dá)水平比較

3 討論

近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率逐年升高，已引起人們的廣泛關(guān)注。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到僅根據(jù)以往的臨床病理指標(biāo)已不足以對甲狀腺癌的早期診斷和預(yù)后做出準(zhǔn)確的判斷，而需要從基因水平尋找進(jìn)一步判斷的方法。BRAFV600E基因突變及miRNAs的表達(dá)失調(diào)在甲狀腺癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。

多種miRNA在甲狀腺癌中的表達(dá)水平有不同程度的上調(diào)或下調(diào)，如miR-146、miR-155、miR-181、miR-187、miR-221、miR-222、miR-224、miR-197、miR-30、miR-152等[3-5]。其中miR-146及miR-181上調(diào)均可通過調(diào)節(jié)核因子-κB通路而促進(jìn)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化[6-7]；同時(shí)BRAFV600E基因突變同樣可以通過核因子-κB的活化增加金屬蛋白酶組織抑制劑-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-3的表達(dá)，從而增加甲狀腺癌的侵襲性[8]。而miRNAs的表達(dá)與BRAFV600E基因突變有無相關(guān)性尚有爭論。

既往的實(shí)驗(yàn)研究表明，miR-181家族各成員在大部分的腫瘤中起到致癌作用，但在非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌作用[9-11]。其中miR-181a作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)因子的作用在肺腺癌細(xì)胞系中被證實(shí)[12]。miR-181b以轉(zhuǎn)化生長因子-β1依賴性方式調(diào)節(jié)肺腺癌[13]。對于患有腎乳頭狀細(xì)胞癌的患者，miR-181c的下調(diào)表達(dá)與更差的總生存期相關(guān)[4]。在膠質(zhì)瘤及B細(xì)胞淋巴瘤中miR-181d的靶基因強(qiáng)調(diào)其腫瘤抑制作用[14]。其中miR-181b在某些腫瘤如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌中高表達(dá)[15-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-181b和miR-181d均在甲狀腺癌中呈高表達(dá)，但各自在甲狀腺癌中的作用尚不明確。Qiu等[18]的研究顯示，miR-146a和miR-146b在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-146a在甲狀腺癌中高表達(dá)，但根據(jù)以往諸多實(shí)驗(yàn)推測，雖然miR-146b較miR-146a表達(dá)低，但miR-146b在甲狀腺癌中可能同樣呈高表達(dá)狀態(tài)。而關(guān)于miR-146對甲狀腺癌生物學(xué)行為的影響需還進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

BRAF基因V600E的點(diǎn)突變是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑異常的主要原因，而MAPK途徑的異常激活是甲狀腺癌的主要遺傳學(xué)改變。該信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和凋亡的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a及miR-181家族中各成員的表達(dá)在BRAFV600E基因突變細(xì)胞株BCPAP中較無BRAFV600E基因突變細(xì)胞株TPC-1明顯升高，miR-146b的表達(dá)明顯減低。該結(jié)果表明miR-146及miR-181家族中各成員的表達(dá)與BRAFV600E基因突變有極強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。Chou等[19]的研究同樣顯示，在BRAFV600E基因突變的甲狀腺乳頭狀癌患者中miR-146b表達(dá)顯著低于對照的BRAFV600E基因未突變組，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

雖然關(guān)于甲狀腺癌中miRNA相關(guān)研究仍處于初級(jí)階段，而且miRNA的表達(dá)失調(diào)在甲狀腺癌中發(fā)揮的作用及機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。但是，可以肯定miRNAs在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，并且miRNAs在外周血中表達(dá)較為穩(wěn)定，不易被內(nèi)源性RNA酶降解。故本研究為下一步通過體外調(diào)控miR-146a、miR-181b、miR-181d的表達(dá)對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)。BRAFV600E基因突變和miR-146及miR-181家族成員有望成為甲狀腺惡性腫瘤篩查、診斷、預(yù)后評估新的分子標(biāo)記物。