枸杞多糖通過下調(diào)miR-365抑制皮膚鱗癌A431細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

陳姣蓉，王嘉琪，黃 征

皮膚鱗癌是繼基底細(xì)胞癌之后另一常見的非黑色素性皮膚癌，好發(fā)于50歲以上的老年人，多見于手背、頭皮和面部等光暴露部位，可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移危及患者的生命安全[1-2]。目前，手術(shù)根治性切除仍是皮膚鱗癌治療的重要手段，但隨著人們生活水平的提高，患者對(duì)術(shù)后要求不斷升高，如何最大限度地改善和保留病灶處的功能與外觀是近年來的研究熱點(diǎn)之一。枸杞多糖(LBP)是常用補(bǔ)益中藥枸杞的主要活性成分之一，已被證實(shí)在膀胱癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤疾病中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤作用[3-6]，但LBP與皮膚鱗癌的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究采用不同濃度的LBP處理人皮膚鱗癌A431細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并探討可能的分子機(jī)制，以期為皮膚鱗癌的治療提供新的方向和線索。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑與儀器 人皮膚鱗癌細(xì)胞株A431細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫，LBP(純度90%)購于南京景竹生物公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胰蛋白酶、MTT試劑購于美國Amresco公司，RIPA裂解液購于上海碧云天公司，LipofectamineTM2000、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司，miR-365mimics及其陰性對(duì)照miR-NC購于上海吉瑪生物公司。miR-365和U6內(nèi)參檢測試劑盒購于上海諾論生物醫(yī)藥公司。Bax抗體、Bcl-2抗體購于美國Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于江蘇碧云天公司。MCO18AIC型CO2培養(yǎng)箱購于日本SANYO公司，MK3型多功能酶標(biāo)儀購于上海Thermo公司，Gel Doc 2000凝膠掃描儀購于美國BIO-RAD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 采用添加10%胎牛血清和50 μg/ml青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱(溫度37℃、濕度飽和、CO2體積分?jǐn)?shù)5%)常規(guī)培養(yǎng)A431細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)所有細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ①LBP影響A431細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：根據(jù)LBP藥物濃度不同將A431細(xì)胞分為4組，分別為0、250、500和1000 mg/L組。②miR-365作用實(shí)驗(yàn)：將A431細(xì)胞分為Con組(未給予LBP處理)、LBP組(給予1000 mg/L的LBP處理48 h)、LBP+miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC 24 h后給予1000 mg/L的LBP處理48 h)和LBP+miR-365組(轉(zhuǎn)染miR-365mimics 24 h后給予1000 mg/L的LBP處理48 h)。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將A431細(xì)胞以適當(dāng)密度接種至6孔細(xì)胞板上，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)，將miR-365 mimics和miR-NC參照LipofectamineTM2000說明書步驟轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染4 h后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4MTT法檢測A431細(xì)胞增殖 以胰蛋白酶消化收集待檢測的A431細(xì)胞，以每孔4000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上。每組設(shè)5個(gè)平行孔。CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)所需時(shí)間后，取出培養(yǎng)板，加入5 g/L的MTT試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，再加入200 μl二甲基亞砜震蕩反應(yīng)10 min。多功能酶標(biāo)儀在570 nm處檢測各組細(xì)胞吸光度值。以藥物處理組與空白對(duì)照組吸光度值的比值表示細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5RT-PCR檢測A431細(xì)胞中miR-365的表達(dá) 收集待檢測的A431細(xì)胞，加入Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取模板cDNA 2 μl，加入濃度為5 pmol/ml的上下游引物各2 μl、SYBR Green Mix(2×)25 μl和ddH2O 21 μl配成50 μl的反應(yīng)體系；按照95℃ 300 s，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s(共40個(gè)循環(huán))的反應(yīng)條件，參照miR-365和U6內(nèi)參檢測試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計(jì)算A431細(xì)胞中miR-365的表達(dá)。

1.6Western blot檢測A431細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá) 向待測的A431細(xì)胞中加入RIPA裂解液抽提總蛋白。以BCA法對(duì)總蛋白定量后，加入2×蛋白上樣緩沖液沸水浴加熱5 min。參照試劑盒說明書配制SDS-PAGE凝膠后，放入電泳槽內(nèi)，按照每孔50 μg變性蛋白上樣至凝膠孔中，以80 V電壓電泳20 min后換成120 V電壓至電泳結(jié)束。以100 mA恒流電轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，取出膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中搖床孵育2 h。以1∶1000的一抗工作液4℃孵育24 h后，1∶2000的二抗工作液室溫孵育1 h。滴加發(fā)光劑顯影、曝光，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

2 結(jié)果

2.1LBP對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響 與0 mg/L組比較，250 mg/L組A431細(xì)胞增殖無顯著影響(P>0.05)，而500和1000 mg/L組能夠呈時(shí)間-劑量依賴性抑制A431細(xì)胞增殖(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度和時(shí)間LBP對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響

圖2 不同濃度LBP對(duì)A431細(xì)胞中miR-365表達(dá)的影響

2.4miR-365表達(dá)對(duì)LBP調(diào)控A431細(xì)胞增殖的影響 與Con組比較，LBP組和LBP+miR-NC組細(xì)胞的增殖活力均顯著降低(P<0.05)；與LBP組比較，LBP+miR-NC組細(xì)胞增殖活力無顯著變化(P>0.05)，但LBP+miR-365組的細(xì)胞增殖活力顯著升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 miR-365表達(dá)對(duì)LBP調(diào)控A431細(xì)胞增殖的影響

2.5miR-365過表達(dá)對(duì)LBP調(diào)控A431細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 與Con組比較，LBP組和LBP+miR-NC組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與LBP組比較，LBP+miR-NC組細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平無顯著改變(P>0.05)，但LBP+miR-365組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，而Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖5。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組A431細(xì)胞中miR-365的表達(dá)水平

圖5 miR-365過表達(dá)對(duì)LBP調(diào)控A431細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

3 討論

中藥枸杞子是茄科寧夏枸杞的成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎和益精明目的功效[7]，還被證實(shí)具有抗氧化、抗衰老、降血糖和抗腫瘤等藥理作用[8-10]；LBP是枸杞子的主要活性成分，因具有來源廣泛，不良反應(yīng)低和不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)勢，逐漸引起腫瘤研究學(xué)者們的關(guān)注。在MMTV-PyMT乳腺癌小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，LBP可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成等作用抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[11]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，LBP可通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9和抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]；LBP還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬抑制人舌鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖[13]。本研究以不同濃度(0、250、500和1000 mg/L)LBP處理皮膚鱗癌A431細(xì)胞不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，500、1000 mg/L的LBP能夠呈時(shí)間-劑量依賴性抑制A431細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，LBP可通過抑制癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抗皮膚鱗癌的作用。

除上述作用外，LBP還可通過激活Nrf2對(duì)紫外線照射引起的人皮膚成纖維細(xì)胞和人角質(zhì)形成細(xì)胞損傷等具有較好的保護(hù)作用[14-15]。微小RNA是一類長約22個(gè)核苷酸的RNA分子，與多種人類疾病的發(fā)生相關(guān)[16-17]。既往研究證實(shí)，過度的紫外線照射是導(dǎo)致皮膚鱗癌發(fā)生的重要原因[18-20]，而紫外線照射可引起miR-365表達(dá)升高，高表達(dá)的miR-365可通過靶向核因子I/B在皮膚鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[21-22]；另外以抗miR-365寡核苷酸作用后可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯G1和細(xì)胞凋亡抑制皮膚腫瘤的形成[23]。為了探討LBP抗皮膚鱗癌的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測miR-365的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，500、1000 mg/L的LBP能夠呈劑量依賴性抑制miR-365的表達(dá)。這提示miR-365可能參與了LBP調(diào)控皮膚癌細(xì)胞增殖的過程。為了進(jìn)一步探討miR-365在皮膚癌細(xì)胞增殖中的作用，本研究將miR-365mimics轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞中，給予1000 mg/L的LBP處理，結(jié)果檢測到成功上調(diào)miR-365表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)LBP對(duì)A431細(xì)胞增殖的抑制作用；同時(shí)，還可有效逆轉(zhuǎn)LBP引起的抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低和促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高[24-26]。上述結(jié)果表明，miR-365通過調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)抑制LBP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。提示miR-365參與了LBP抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖的分子過程。

綜上所述，LBP可抑制皮膚鱗癌A431細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與LBP抑制miR-365的表達(dá)有關(guān)。