LV-GlyT2 siRNA對骨癌痛大鼠嗎啡耐受形成的影響*

徐偉，王健，丁卓峰，李珍，張潔

（1.湖南省婦幼保健院 麻醉科，湖南 長沙 410008；2.中南大學湘雅醫(yī)院 麻醉科，湖南 長沙 410008）

癌痛是惡性腫瘤患者最常見的癥狀之一。許多的惡性腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌常伴有骨轉移，導致嚴重的骨破壞和癌性疼痛，嚴重影響患者的生活質量[1-3]。嗎啡是目前臨床上用來治療中重度癌痛的常用藥物[4]。但長期使用嗎啡會帶來許多不良反應，如便秘、搔癢及嗎啡耐受等[5]。其中，嗎啡耐受是影響臨床上嗎啡使用最主要的不良反應，目前其具體機制仍不明確[6-7]。甘氨酸轉運體2（glycine transporter 2,GlyT2）是調控突觸間甘氨酸濃度的重要轉運體。既往研究發(fā)現，鞘內注射GlyT2 抑制劑或敲除GlyT2 可以減輕骨癌痛，并增強單次注射嗎啡的鎮(zhèn)痛效能[8]。但目前尚未有研究探尋抑制GlyT2 表達對大鼠骨癌痛嗎啡耐受的影響。本研究擬復制骨癌痛模型，使用慢病毒載體部分敲除GlyT2 表達，明確其對骨癌痛大鼠嗎啡耐受形成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Walker 256 乳腺癌細胞購自北京鼎國昌盛生物公司。von Frey 纖維絲（美國Northcoast 公司），7370 型熱痛儀（意大利UGO 公司）。兔抗GlyT2 抗體（美國Abcam 公司），山羊抗兔辣根過氧化物酶標記IgG二抗（美國Jackson 公司），GlyT2 siRNA 慢病毒載體（LV-GlyT2 siRNA）（上海吉凱基因化學技術有限公司）。

1.2 動物模型的復制與分組

清潔級成年雌性SD 大鼠，體重180 ～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于中南大學實驗動物學部，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。采用改良Yaksh 法進行鞘內置管[9]，將鞘內置管成功的30 只大鼠隨機分為鞘內注射生理鹽水組（NS 組）、鞘內注射陰性對照病毒組（LVNC 組）及鞘內注射GlyT2 siRNA 病毒組（LV-GlyT2 siRNA 組），每組10 只。參照MAO-YING 等[10]的方法復制骨癌痛模型，在大鼠左側后肢脛骨上段骨髓腔注入Walker 256 乳腺癌細胞10μl（4×105個/ml）。NS 組、LV-NC 組、LV-GlyT2 siRNA 組大鼠接種后第7 天分別鞘內注射生理鹽水10μl，陰性對照病毒10μl（滴度1×109TU/ml），GlyT2 siRNA陽性病毒載體10μl（滴度1×109TU/ml）。接種后第9 天開始3 組大鼠均鞘內注射嗎啡（湖北宜昌人福藥業(yè)，批號：H21022436），10μg/次，2 次/d，連續(xù)7 d。

1.3 疼痛相關行為學檢測

1.3.1 機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold,MWT）3 組大鼠分別在癌細胞接種前及接種后7 d 測定術側后肢MWT[11]。將von Frey 纖維絲垂直伸向大鼠后肢足底，當大鼠出現抬足或舔足時，記錄von Frey 克數，每次間隔10 min。每組大鼠測定3 次，取最小值。

1.3.2 最大可能效能百分比（percent of the maximum possible effect,%MPE）3 組大鼠在嗎啡注射前，以及注射后1 d、3 d、5 d、7 d 測量大鼠熱痛閾甩尾潛伏期，并計算%MPE[12]。將大鼠尾部置于刺激儀輻射源正中，刺激儀輻射強度設為54℃，臨界值設為20 s，當尾部甩動時記錄時間。測量3 次取平均值，每次間隔10 min。以%MPE 表示嗎啡的鎮(zhèn)痛效能，%MPE=（效應時間-基礎時間）/（臨界值-基礎時間）×100%。

1.4 Western blotting 檢測大鼠脊髓GlyT2 蛋白的表達

取大鼠脊髓腰膨大，加入預冷的RIPA 裂解液，離心后取上清液，利用BCA 法測量蛋白濃度，隨后將各組50μg 蛋白樣品上樣，在10% SDS-PAGE 凝膠中，80 V 恒壓電泳30 min，然后120 V 電泳60 min。隨后恒流280 mA，60 min 轉膜。轉膜成功后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗GlyT2 多克隆抗體（1∶400），兔抗Tublin 抗體（1∶2 000）4℃孵育過夜，第2 天用1% TBST 室溫洗膜后加入生物素標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，清洗后用ECL 發(fā)光液進行顯色。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量數據采用均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學結果

3 組大鼠在癌細胞接種前及接種后7 d 的術側后肢MWT 比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間的大鼠MWT 有差異（F=526.900，P=0.000）；各組大鼠癌細胞接種后術側MWT 均較接種前下降（P＜0.05），說明骨癌痛模型復制成功。②3 組大鼠MWT 無差異（F=0.077，P=0.926）。③3 組大鼠MWT 變化趨勢無差異（F=1.796，P=0.185）。見表1。

3 組大鼠注射嗎啡后1 d、3 d、5 d、7 d 的%MPE比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點大鼠%MPE 有差異（F=575.280，P=0.000）。②3 組大鼠%MPE 有差異（F=19.461，P=0.000）。注射嗎啡后5 d 和7 d，LV-GlyT2 siRNA 組%MPE 高于其他兩組（P＜0.05），說明鞘內注射LV-GlyT2 siRNA可以緩解骨癌痛大鼠嗎啡耐受。③3 組大鼠%MPE變化趨勢有差異（F=15.25，P=0.000）。見表2 和圖1。

表1 3 組大鼠癌細胞接種前后術側后肢MWT 比較 （n=10，g，±s）

表1 3 組大鼠癌細胞接種前后術側后肢MWT 比較 （n=10，g，±s）

組別 接種前 接種后7 d NS 組 8.80±1.39 2.42±1.46 LV-NC 組 8.40±1.26 3.20±1.39 LV-GlyT2 siRNA 組 8.80±1.03 2.60±1.27

表2 3 組大鼠不同時間點%MPE 比較 （n=10，%，±s）

表2 3 組大鼠不同時間點%MPE 比較 （n=10，%，±s）

組別 1 d 3 d 5 d 7 d NS 組 94.32±8.58 58.09±11.34 27.29±12.24 18.20±9.46 LV-NC 組 94.59±7.93 60.20±10.72 32.09±8.65 19.86±12.76 LV-GlyT2 siRNA 組 96.09±5.71 70.61±11.07 55.20±8.35 52.34±7.25

圖1 3 組大鼠%MPE 的變化趨勢 （n=10，±s）

2.2 3 組大鼠GlyT2 蛋白相對表達量比較

嗎啡注射第7 天，3 組大鼠GlyT2 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=53.880，P=0.000）；LV-GlyT2 siRNA 組低于LV-NC 組和NS組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3 組大鼠嗎啡注射后7 d 脊髓腰膨大GlyT2 蛋白的表達

3 討論

本研究結果表明，骨癌痛大鼠鞘內注射LVGlyT2 siRNA 后脊髓GlyT2 表達下調，在給予嗎啡處理后的第5 天和第7 天，大鼠%MPE 較LV-NC 組及NS 組明顯升高，說明鞘內注射GlyT2 siRNA 慢病毒載體能夠延緩骨癌痛大鼠嗎啡耐受的形成。

GlyT2 是調節(jié)突觸間甘氨酸濃度的重要轉運體，其可以將突觸間隙中的甘氨酸重新攝入突觸前囊泡，清除突觸間隙中的甘氨酸[13-14]。甘氨酸是中樞神經系統重要的抑制性神經遞質，在突觸可塑性形成及疼痛信號傳導中發(fā)揮重要作用[15-17]。甘氨酸在神經系統中的作用分為2 種：一種是與體內甘氨酸受體結合，抑制神經沖動傳導；另一種是與NMDA 興奮性受體上的甘氨酸-B 位點作用，協同激活NMDA 受體，參與興奮性神經傳遞[18-19]。研究發(fā)現，GlyT2 選擇性抑制劑如Org25543、ALX1393 及GT-0198 可以減輕神經病理性疼痛[20-22]。最近有研究發(fā)現，鞘內注射GlyT2 抑制劑或GlyT2 siRNA 可以緩解骨癌痛相關的痛覺異常及痛覺過敏，并且可以增強單次給予嗎啡的鎮(zhèn)痛效能[8]。本實驗中骨癌痛大鼠鞘內注射GlyT2 siRNA 慢病毒載體后GlyT2 表達下調，使用嗎啡處理后，大鼠%MPE值仍維持在50%以上，說明抑制GlyT2 表達能延緩嗎啡耐受的形成。GlyT2 抑制劑有時難以透過血-腦屏障，且靶組織的滲透作用較弱，因此選擇操作簡便、效果可靠的給藥方式保證GlyT2 表達下調或功能抑制是研究及臨床運用的關鍵。慢病毒載體介導的LVGlyT2 siRNA 可以相對局限地作用于注射部位，能夠轉染多種神經細胞，不良反應少，并且單次注射后可以長期且穩(wěn)定地發(fā)揮生物學效應[23-24]。由于慢病毒載體注射入大鼠體內后一般4 d 或5 d 開始產生作用，并在1 周左右達最大效應，因此本研究選擇在接種癌細胞后第7 天通過鞘內注射GlyT2 siRNA 慢病毒載體，以期在嗎啡發(fā)揮作用期間產生最佳效應。

LV-GlyT2 siRNA 緩解嗎啡耐受的具體機制不明確，可能與增強甘氨酸能神經沖動有關。研究發(fā)現，給予GlyT2 抑制劑可以延長脊髓X 板層神經元中甘氨酸能IPSPs 的衰減時間[25]，提示GlyT2 抑制劑可以在感覺神經元中促進甘氨酸能神經傳遞，其認為抑制膠質細胞或神經元中甘氨酸轉運體可以提高脊髓中甘氨酸濃度，并延長甘氨酸能電位的持續(xù)時間。WHITEHEAD 等[26]通過微透析的方法發(fā)現，給予大鼠GlyT2 選擇性抑制劑可以提高大鼠脊髓腦脊液中的甘氨酸濃度。筆者將在后續(xù)實驗中測量脊髓腦脊液中的甘氨酸濃度，以明確LV-GlyT2 siRNA 緩解嗎啡耐受的具體機制。

綜上所述，大鼠鞘內注射GlyT2 siRNA 慢病毒載體可延緩骨癌痛大鼠嗎啡耐受的形成。