亞硒酸鈉對皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

荀偉 魏海濤 劉瑞 王敏

【摘要】 目的 觀察亞硒酸鈉對大鼠腹壁淺血管皮瓣缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 利用雌性Wistar大鼠制作腹壁淺血管為蒂的缺血再灌注皮瓣模型并進(jìn)行實驗， 將30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血再灌注+亞硒酸鈉組、缺血再灌注+生理鹽水組， 每組10只。假手術(shù)組不做缺血再灌注處理， 缺血再灌注+亞硒酸鈉組術(shù)前3 d腹腔注射亞硒酸鈉0.5 mg/kg（每24小時1次）， 缺血再灌注+生理鹽水組術(shù)前3 d腹腔注射等體積生理鹽水（每24小時1次）。缺血再灌注+亞硒酸鈉組與缺血再灌注+生理鹽水組于皮瓣缺血1 h再灌注1 h之后， 假手術(shù)組于術(shù)后2 h， 取皮瓣中間靠外側(cè)組織檢測丙二醛含量， 光鏡下觀察病理組織變化。術(shù)后7 d大體觀察皮瓣存活情況。結(jié)果 缺血再灌注+生理鹽水組大鼠皮瓣再灌注后丙二醛含量為（17.89±2.85）nmol/g， 與假手術(shù)組的（10.38±3.45）nmol/g比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;缺血再灌注+亞硒酸鈉組大鼠皮瓣缺血再灌注后丙二醛含量為（11.06±1.47）nmol/g，?與缺血再灌注+生理鹽水組的（17.89±2.85）nmol/g比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。病理組織變化：假手術(shù)組脂肪組織內(nèi)充滿脂肪滴， 胞質(zhì)位于細(xì)胞邊緣成一薄層， 核亦被擠到細(xì)胞的邊緣， 細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整， 飽滿;缺血再灌注+生理鹽水組可見脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞， 雜亂無章。術(shù)后7 d皮瓣大體存活情況：亞硒酸鈉組皮瓣成活面積較生理鹽水組皮瓣成活面積大。手術(shù)7 d后皮瓣情況及成活面積：缺血再灌注+生理鹽水組皮瓣大部分出現(xiàn)顏色變黑， 干燥收縮， 質(zhì)地變硬， 彈性及回縮性變差， 脆性增加， 刀切后無出血等壞死的表現(xiàn)。缺血再灌注+亞硒酸鈉組皮瓣只是在邊緣區(qū)域出現(xiàn)部分壞死組織， 成活面積大于生理鹽水組。假手術(shù)組皮瓣僅僅是縫線處有微小組織壞死， 造成縫線脫落， 皮瓣幾乎完全成活。結(jié)論 亞硒酸鈉具有拮抗氧自由基， 減輕自由基的脂質(zhì)過氧化作用， 對緩解皮瓣的缺血再灌注損傷起著一定的作用。

【關(guān)鍵詞】 亞硒酸鈉;皮瓣;缺血再灌注損傷

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.27.091

亞硒酸鈉在20世紀(jì)30年代首次在臨床用于治療克山病。隨著克山病被基本控制， 亞硒酸鈉也漸漸淡出了臨床。近30年來， 隨著科學(xué)界對金屬元素硒的研究逐漸深入， 亞硒酸鈉又重新引起臨床的關(guān)注。多年來的研究已經(jīng)證實亞硒酸鈉具有多種生物學(xué)作用， 如免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞生長、減少射線所致的損傷， 抗病毒、抗衰老、抗氧自由基等[1-3]。亞硒酸鈉在缺血再灌注損傷中抗氧自由基保護(hù)組織器官的作用目前研究很廣。研究者們已經(jīng)以心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟及腸等組織器官為媒介， 探討了亞硒酸鈉在缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。但是目前將亞硒酸鈉應(yīng)用于皮瓣的缺血再灌注損傷還未見相關(guān)報道。本實驗則是利用皮瓣作為相關(guān)載體， 將亞硒酸鈉應(yīng)用其中， 進(jìn)一步探討缺血再灌注損傷中亞硒酸鈉是否具有保護(hù)作用， 從而為臨床外科皮瓣圍手術(shù)期用藥提供新的手段和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 健康成年雌性Wistar大鼠30只， 體重（220±10）g， 內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心提供。

1. 2 主要藥品與試劑 亞硒酸鈉片（上海天賜福生物工程有限公司）0.2 mg×30片， 考馬斯亮藍(lán)蛋白含量測試盒及丙二醛測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1. 3 主要設(shè)備 離心機(jī) （XIANG YI H1650-W）， 電熱恒溫水浴箱（CIMD 新苗 H.SMX-420BS）， 分光光度計， 電子天平 （SARLTORIUS BS110 S MAX 110 g d=0.1 mg）。

1. 4 實驗方法

1. 4. 1 動物分組 30只大鼠， 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、缺血再灌注+亞硒酸鈉組、缺血再灌注+生理鹽水組， 每組10只。假手術(shù)組不做缺血再灌注處理， 缺血再灌注+亞硒酸鈉組術(shù)前3 d腹腔注射亞硒酸鈉0.5 mg/kg（每24小時1次）， 缺血再灌注+生理鹽水組術(shù)前3 d腹腔注射等體積生理鹽水（每24小時1次）。

1. 4. 2 動物模型制作 用腹腔注射的方法注入10%水合氯醛0.4 ml/100 g麻醉Wistar大白鼠。誘導(dǎo)成功后， 仰臥位綁定于鼠臺上， 充分暴露腹部。右下腹部剪毛， 硫化鈉脫毛（范圍應(yīng)大于擬定皮瓣尺寸）。用標(biāo)記筆在右下腹皮膚上標(biāo)記3.0 cm×5.0 cm劃線用Petry-Wortham法進(jìn)行皮瓣手術(shù)操作。常規(guī)碘伏消毒， 帶無菌手套， 鋪無菌孔巾， 將手術(shù)范圍充分暴露后實施手術(shù)。沿標(biāo)記線剪開皮膚直達(dá)皮下筋膜層， 分離筋膜層與腹肌后仔細(xì)尋找腹壁淺動靜脈及股動靜脈并充分暴露各血管。之后將皮瓣完全游離并觀察皮瓣的血液循環(huán)情況。仔細(xì)分離并暴露腹壁淺動靜脈， 在股血管分出腹壁淺血管處用顯微止血夾（窄形5）夾閉制造缺血狀態(tài)。此時開始計時， 1 h后將止血夾移除制造再灌注狀態(tài)， 再灌注1 h后取皮瓣中段邊緣全層皮瓣組織

1.0 cm×1.0 cm用于丙二醛含量測定及病理組織切片觀察。最后將皮瓣縫合于原位置上， 碘伏消毒， 紗布簡單包扎后分籠飼養(yǎng)。

1. 4. 3 丙二醛含量測定 將取下皮瓣制備成0.5 cm×

1.0 cm大小組織2份， 一份用于丙二醛含量測定， 另一份用于病理組織切片觀察。將組織塊上的動物毛發(fā)盡量清除干凈， 冰生理鹽水清洗， 吸水紙擦干， 微量天平稱重， 加9倍重生理鹽水， 勻漿器勻漿， 3000 r/min離心機(jī)離心10 min后取上清液， 按照說明書操作， 先測組織蛋白含量， 記錄所得數(shù)據(jù)。后測組織中丙二醛含量（需要蛋白含量值代入公式）。

1. 4. 4 病理切片 取另一份0.5 cm×1.0 cm組織放入10%甲醛固定液中固定24 h， 后逐步進(jìn)行脫水透明， 侵蠟包埋， 切片貼片， 染色封片等步驟， 成功后顯微鏡下觀察組織學(xué)變化。

1. 4. 5 大體觀察 術(shù)后7 d觀察皮瓣顏色， 回縮彈性， 質(zhì)地， 切割后有無出血及皮瓣成活面積。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組手術(shù)后2 h皮瓣組織丙二醛含量比較 缺血再灌注+生理鹽水組大鼠皮瓣再灌注后丙二醛含量為（17.89±2.85）nmol/g， 與假手術(shù)組的（10.38±3.45）nmol/g

比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.307， P<0.05）;缺血再灌注+亞硒酸鈉組大鼠皮瓣缺血再灌注后丙二醛含量為（11.06±1.47）nmol/g， 與缺血再灌注+生理鹽水組的（17.89±

2.85）nmol/g比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.735， P<0.05）。

2. 2 三組大鼠皮瓣病理形態(tài)結(jié)構(gòu) 由于手術(shù)后2 h即取材做病理組織學(xué)切片觀察， 所以皮瓣組織大部分細(xì)胞還沒有出現(xiàn)明顯變化， 只有脂肪組織發(fā)生了變化。假手術(shù)組脂肪組織內(nèi)充滿脂肪滴， 胞質(zhì)位于細(xì)胞邊緣成一薄層， 核亦被擠到細(xì)胞的邊緣， 細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整， 飽滿。缺血再灌注+生理鹽水組可見脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞， 雜亂無章。缺血再灌注+亞硒酸鈉組脂肪結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定， 無顯著變化。

2. 3 三組皮瓣術(shù)后7 d大體觀察 缺血再灌注+生理鹽水組皮瓣大部分出現(xiàn)顏色變黑， 干燥收縮， 質(zhì)地變硬， 彈性及回縮性變差， 脆性增加， 刀切后無出血等壞死的表現(xiàn)。缺血再灌注+亞硒酸鈉組皮瓣只是在邊緣區(qū)域出現(xiàn)部分壞死組織， 成活面積大于生理鹽水組。假手術(shù)組皮瓣僅僅是縫線處有微小組織壞死， 造成縫線脫落， 皮瓣幾乎完全成活。

3 討論

缺血組織再灌注時造成的微血管和實質(zhì)器官的損傷主要是由活性氧自由基引起的， 這已在多種器官中得到證明。在缺血組織中具有清除自由基的抗氧化酶類合成能力發(fā)生障礙， 從而加劇了自由基對缺血后再灌注組織的損傷[4-6]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。硒是GSH-Px酶系的組成成分， 其能催化GSH變?yōu)檠趸凸入赘孰模℅SSG）， 使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物， 同時促進(jìn)H2O2的分解， 從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸， 其活力大小可以反映機(jī)體硒水平。人體適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充金屬元素硒有助于提高抗氧化能力， 而且硒的制劑形式與其抗氧化能力有很大的關(guān)聯(lián)， 實驗證實亞硒酸鈉在各種硒化合物中藥理作用最強(qiáng)[7， 8]。本實驗在皮瓣手術(shù)前3 d開始給予大鼠預(yù)防劑量的亞硒酸鈉就是要提高其抗氧化能力就是基于這個理論根據(jù)。氧自由基能夠攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸（PUFA）引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)， 并因此形成了脂質(zhì)過氧化物， 如丙二醛。本實驗檢測丙二醛含量目的是其能夠間接反應(yīng)機(jī)體此時的抗氧化能力的高低。本實驗取材測定皮瓣組織丙二醛含量為： 缺血再灌注+生理鹽水組大鼠皮瓣再灌注后丙二醛含量為

（17.89±2.85）nmol/g， 與假手術(shù)組的（10.38±3.45）nmol/g

比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;缺血再灌注+亞硒酸鈉組大鼠皮瓣缺血再灌注后丙二醛含量為（11.06±

1.47）nmol/g， 與缺血再灌注+生理鹽水組的（17.89±

2.85）nmol/g比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗結(jié)果表明， 亞硒酸鈉能夠增加抗氧化酶的作用， 抑制氧自由基的蓄積， 從而降低生物膜的損傷， 降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)， 從而使丙二醛的含量降低。

本實驗再灌注后取材病理切片觀察， 僅僅于術(shù)后2 h就出現(xiàn)了一定的組織結(jié)構(gòu)變化。首先體現(xiàn)在脂肪細(xì)胞上面， 假手術(shù)組脂肪組織內(nèi)充滿脂肪滴， 胞質(zhì)位于細(xì)胞邊緣成一薄層， 核亦被擠到細(xì)胞的邊緣， 細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整， 飽滿。缺血再灌注+生理鹽水組可見脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞， 雜亂無章。缺血再灌注+亞硒酸鈉組改變介于兩者之間。本實驗的結(jié)果充分說明亞硒酸鈉具有減少氧自由基， 促進(jìn)皮瓣成活的作用。術(shù)后7 d大體觀察各實驗組皮瓣成活面積， 雖然沒有做統(tǒng)計學(xué)分析， 但還是能從一定角度說明亞硒酸鈉可以提高皮瓣的成功幾率。

綜上所述， 亞硒酸鈉能夠有效抑制氧自由基的產(chǎn)生， 同時減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)， 降低丙二醛水平， 提高皮瓣存活率。

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[收稿日期：2020-05-11]