枸櫞酸愛地那非人肝微粒體代謝產(chǎn)物鑒定及性別差異*

趙曉悅，宋俊科，杜冠華

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

磷酸二酯酶是有多種亞型的一類以磷酸酯為底物的水解酶，Ⅴ型磷酸二酯酶(phosphodiesterase 5，PDE5)主要分布于陰莖海綿體、肺、大腦、血管平滑肌細(xì)胞，血小板以及心肌細(xì)胞，可特異性水解環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate， cGMP)，從而調(diào)節(jié)陰莖和肺等器官或組織中血管平滑肌收縮力，參與血小板聚集過程，影響腦內(nèi)cGMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑[1]。2005年，美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)PDE5選擇性抑制藥西地那非用于治療肺動(dòng)脈高壓，緩解患者呼吸困難等癥狀[2]。PDE5選擇性抑制藥對(duì)于心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病的治療和預(yù)防作用也受到越來越多的研究和關(guān)注。

枸櫞酸愛地那非是我國自主研發(fā)的一種高效PDE5選擇性抑制藥，屬于化學(xué)藥品第 1.1類新藥[3]。與同類藥物分子相比，愛地那非分子對(duì)PDE5的特異性結(jié)合力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)共平面性好，酯水分配比合理，有利于藥物吸收和分布[4]。由于愛地那非前期開發(fā)主要針對(duì)男性勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)的臨床治療，其臨床前研究全部使用雄性動(dòng)物，臨床試驗(yàn)受試者也均為男性[5-10]。因此，探究性別差異對(duì)愛地那非代謝的影響，對(duì)于愛地那非藥理學(xué)應(yīng)用的開發(fā)和研究十分必要。

筆者在本研究建立不同性別來源人肝微粒體體外代謝孵育體系模型，通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，鑒定愛地那非代謝產(chǎn)物，探究不同性別人肝微粒體代謝差異，以期為擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

從學(xué)生的舉例中選擇一個(gè)命題，做為課堂研究的對(duì)象.如在本節(jié)課中，有同學(xué)舉例“若2b=a+c，則a,b,c成等差數(shù)列”，以下討論便圍繞此命題展開.

在鉆進(jìn)機(jī)構(gòu)抵達(dá)限幅機(jī)構(gòu)預(yù)定位置時(shí)，對(duì)接鎖合組件能夠?qū)崿F(xiàn)限幅機(jī)構(gòu)與鉆進(jìn)機(jī)構(gòu)的鎖定，從而使得限幅機(jī)構(gòu)與鉆進(jìn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行隨動(dòng)，保證后續(xù)的鉆取采樣作業(yè)順利進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 人肝S9，混合人源肝微粒體，男性肝微粒體，女性肝微粒體[購買自瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司，批號(hào)：X008023(人肝S9)，X038076(混合人源肝微粒體)，MX008064(男性肝微粒體)，F(xiàn)X008064(女性肝微粒體)]；枸櫞酸愛地那非原料藥(悅康藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：019141102，)；其他試劑與溶劑均為市售分析純。

1.2儀器 Waters CQUITY UPLC液相色譜系統(tǒng)，Waters Xevo G2 QTof質(zhì)譜儀，Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，USA)；高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman)；Eppendorf移液器(德國Eppendorf)；Eppendorf離心機(jī)(德國Eppendorf)。

1.4人肝微粒體孵育體系 孵育體系終體積1 mL，其中人肝S9或微粒體蛋白質(zhì)濃度1 g·L-1，愛地那非濃度100 μg·mL-1，以三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(pH值=7.4)補(bǔ)齊體積。37 ℃預(yù)孵5 min，加入終濃度1 mmol·L-1煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide ademine dinucleotide phosphate，NADPH)輔酶溶液啟動(dòng)反應(yīng)。37 ℃恒溫孵育 8 h。到達(dá)終點(diǎn)后加入5倍體積(5 mL)冰乙腈終止反應(yīng)，振蕩3 min，高速離心10 min，吸取上清液吹干。復(fù)溶后振蕩離心，取上清液進(jìn)樣。對(duì)照組不加愛地那非，以Tris-HCl緩沖液代替，其余同上述處理過程。

M4為愛地那非的N-N'脫烷基產(chǎn)物。M4的準(zhǔn)分子離子峰m/z 449.1966比原準(zhǔn)分子離子低40.0313 Da，元素組成為C20H28N6O4S，表明原分子丟失了C3H4結(jié)構(gòu)。M4的二級(jí)質(zhì)譜中存在碎片離子m/z 377.1311，312.1694，和284.1315，而不存在m/z 113.1099和99.0924，表明哌嗪環(huán)結(jié)構(gòu)破壞(N，N'-脫異丙基)。

1.5代謝產(chǎn)物的檢測和鑒定 ①數(shù)據(jù)庫的建立。使用ChemDraw軟件繪制愛地那非化合物結(jié)構(gòu)式，連同微粒體代謝可能發(fā)生的所有反應(yīng)類型(包括Ⅰ相反應(yīng)和Ⅱ相反應(yīng))等相關(guān)信息一起導(dǎo)入沃特世UNIFI 科學(xué)信息系統(tǒng)平臺(tái)系統(tǒng)，形成數(shù)據(jù)庫；②獲得初步鑒定結(jié)果。由UNIFI軟件根據(jù)導(dǎo)入的信息自動(dòng)鑒定識(shí)別可能的代謝產(chǎn)物，并設(shè)置過濾器參數(shù)對(duì)識(shí)別結(jié)果進(jìn)行初步篩選，過濾掉響應(yīng)值<2000、精確質(zhì)量數(shù)誤差>10×10-6的化合物，得到初步的化合物鑒定結(jié)果；③人工識(shí)別和鑒定。參考已有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合愛地那非質(zhì)譜特征、相對(duì)保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、分子式和多級(jí)質(zhì)譜碎片等信息，對(duì)初步鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證核查，得到最終代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果。

1.3分析條件 色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.4%甲酸溶液；洗脫程序：0～2 min(10% A)，>2～47 min(10%→100% A) ，>47～52 min (100% A)，>52～55 min(100%→10% A)， >55～60 min (10% A)；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量為5 μL。

由于目前的企業(yè)大多屬于經(jīng)營權(quán)和所屬權(quán)背離，所以公司的董事會(huì)與監(jiān)理會(huì)需要展現(xiàn)其應(yīng)該具備的功能，對(duì)管理階層開展的工作實(shí)施監(jiān)管，嚴(yán)謹(jǐn)預(yù)防管理階層造假，蒙蔽審計(jì)者，導(dǎo)致企業(yè)在信譽(yù)層面出現(xiàn)虧空，同時(shí)給公司長久的發(fā)展收益帶來影響。另外作為企業(yè)的董事層，需要多加入企業(yè)的人才挑選與培養(yǎng)，重視公司財(cái)務(wù)近期的情況的時(shí)候，針對(duì)財(cái)務(wù)部門用人機(jī)制需要嚴(yán)格把控，嚴(yán)謹(jǐn)防止一人多崗，崗位不劃分的狀況出現(xiàn)。

2 結(jié)果

M3為愛地那非中的N-S鍵斷裂并引入羥基的產(chǎn)物。M3的準(zhǔn)分子離子峰m/z 393.1227，比原準(zhǔn)分子離子低96.1052 Da，元素組成為C17H20N4O5S，且不存在碎片離子m/z 113.1099和99.0924，表明哌嗪環(huán)丟失，吡唑吡啶結(jié)構(gòu)中引入一個(gè)羥基。M3的碎片離子m/z 365.1019元素組成為C15H17N4O5S，表明苯環(huán)上C-O鍵斷裂，丟失C2H4結(jié)構(gòu)。 碎片離子m/z 312.1657和284.1348與原分子相同，表明羥基在C-S鍵斷裂后裂解，推測羥基被引入到與C-S鍵相鄰的碳中。

2.2愛地那非代謝產(chǎn)物的LC-MS表征及性別代謝比較 在NADPH存在的體外人肝微粒體孵育體系中，愛地那非產(chǎn)生了多個(gè)代謝產(chǎn)物。圖2顯示了愛地那非在人肝S9、混合人源肝微粒體、男性肝微粒體、女性肝微粒體孵育體系中代謝8 h得到的代謝產(chǎn)物總離子色譜圖。由表1可知，混合人源肝微粒體、男性肝微粒體和女性肝微粒體中均檢測到了全部8種代謝產(chǎn)物；人肝S9中檢測到除M5和M7以外6種代謝產(chǎn)物。表1詳細(xì)總結(jié)了愛地那非及其8種代謝產(chǎn)物的化學(xué)式、準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時(shí)間、碎片離子信等詳細(xì)色譜和質(zhì)譜信息。8種代謝產(chǎn)物的推測結(jié)構(gòu)和代謝過程如圖3所示。

圖1 愛地那非的MS/MS譜圖及可能的質(zhì)譜裂解途徑

2.3愛地那非代謝產(chǎn)物的LC-MS鑒別 M1和M2 為愛地那非的羥基化產(chǎn)物。M1和M2的準(zhǔn)分子離子峰m/z 505.2228比原準(zhǔn)分子離子高15.9949 Da，分子式為C23H32N6O5S，表明原分子中引入了一個(gè)氧原子。M1的二級(jí)質(zhì)譜解析中包括碎片離子m/z 487.2310(C23H31N6O4S，-H2O)，375.1121，310.1525，282.1216，113.1055，99.0945。其中m/z 375.1121(C17H19N4O4S)，310.1525(C17H17N4O2)，282.1216(C15H13N4O2)比原分子的離子碎片m/z 377.1311(C17H21N4O4S)，312.1585(C17H19N4O2)，284.1281(C15H15N4O2)低2 Da(-2H)，表明羥基的引入位置是吡唑吡啶結(jié)構(gòu)中的丙基側(cè)鏈。碎片離子m/z 113.1055，99.0945與原分子相同，表明M1中哌嗪結(jié)構(gòu)完整。而與M1不同的是，M2中碎片離子m/z 377.1272，312.1657，284.1281與原分子相同，而m/z 111.0959(C6H11N2)比原分子的碎片離子m/z 113.1099(C6H13N2)低2 Da，表明M2的羥基化發(fā)生在哌嗪結(jié)構(gòu)中。

A.人肝S9代謝；B.混合人源肝微粒體代謝；C.男性肝微粒體代謝；D.女性肝微粒體代謝。

圖3 愛地那非在體外人肝微粒體中的代謝途徑

表1 愛地那非及其在人肝微粒體中代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜表征

2.1愛地那非的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)表征 采用LC-MS方法檢測愛地那非色譜和質(zhì)譜裂解行為。保留時(shí)間13.6 min，準(zhǔn)分子離子峰[M + H]+為m/z 489.227 9，分子式為C23H32N6O4S，見圖1。愛地那非產(chǎn)生的二級(jí)碎片離子有m/z 377.1311，312.1585，284.1281，113.1099和99.0924。愛地那非分子失去哌嗪結(jié)構(gòu)(m/z 113.1099)形成碎片離子m/z 377.1311，而后通過C-S鍵裂解形成碎片離子m/z 312.1585，C-O鍵斷裂又進(jìn)一步形成碎片離子m/z 284.1281。碎片離子m/z 113.1099失去烷基產(chǎn)生m/z 99.0924。這些碎片離子信息可用于后續(xù)代謝產(chǎn)物的鑒定和分析。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速600 L·h-1，錐孔氣體流速50 L·h-1，錐孔電壓30 V，毛細(xì)管電壓3 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1200。使用MassLynx V4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析。

M5為M4脫氨基并發(fā)生羥基化的產(chǎn)物。M5的準(zhǔn)分子離子峰m/z 448.1649比M4的準(zhǔn)分子離子低1.0371 Da，元素組成為C20H25N5O5S，表明在M4分子基礎(chǔ)上發(fā)生脫氨基變化的同時(shí)又引入一個(gè)羥基。通過碎片離子m/z 377.1311，311.1547，283.1222的存在推定羥基的引入位置在破壞后的哌嗪結(jié)構(gòu)中。

M6是愛地那非的羥基化和去甲基產(chǎn)物。M6的準(zhǔn)分子離子峰m/z 491.2071比原準(zhǔn)分子離子高1.9792 Da，元素組成為C22H30N6O5S，表明丟失甲基(-CH2)并引入氧原子。M6的二級(jí)質(zhì)譜中存在碎片離子m/z 377.1272，311.1511和284.1349，而不存在m/z 113.1099和99.0924，表明在哌嗪結(jié)構(gòu)中發(fā)生了羥基化和甲基丟失。

M8為M7的脫氫產(chǎn)物。M8的準(zhǔn)分子離子峰m/z 501.1915比M7的準(zhǔn)分子離子低2.0156 Da，元素組成為C23H28N6O5S，表明在結(jié)構(gòu)上失去兩個(gè)氫原子。M8的二級(jí)質(zhì)譜結(jié)構(gòu)與M7相比缺少碎片離子m/z 111.0916，說明失去的氫原子來源于哌嗪結(jié)構(gòu)，脫氫變化后哌嗪結(jié)構(gòu)被破壞。

M7為愛地那非的羥基化和脫氫產(chǎn)物。M7的準(zhǔn)分子離子峰m/z 503.2071比原準(zhǔn)分子離子高13.9792 Da，元素組成為C23H30N6O5S，表明結(jié)構(gòu)上引入一個(gè)羥基并脫去兩個(gè)氫原子。M7的碎片離子m/z 111.0916比原分子的碎片離子m/z 113.1070(C6H13N2)低2.0154 Da，其他碎片離子m/z 377.1351，311.1582和284.1349與原分子相同，表明在哌嗪結(jié)構(gòu)上發(fā)生脫氫變化并引入了氧原子

式中,k(·,·)θc是關(guān)于參數(shù)θc的協(xié)方差函數(shù)。一般而言,協(xié)方差函數(shù)決定了分布的平滑程度。各向同性均方指數(shù)核函數(shù)是經(jīng)常使用的協(xié)方差函數(shù)形式,其解析形式如下:

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由表3可知，在該實(shí)驗(yàn)條件下加標(biāo)回收率范圍為99%～102%，相對(duì)誤差范圍為±2%，得到的的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度較高。

3 討論

研究表明，西地那非在小鼠體內(nèi)的的免疫調(diào)節(jié)作用存在藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)相關(guān)的性別依賴性差異[11]。因此，在愛地那非的開發(fā)過程中，性別差異性研究十分重要。

本研究采用UPLC-Q-TOF MS法，最終共鑒定代謝產(chǎn)物8種，均為水溶性，無明顯毒性結(jié)構(gòu)的Ⅰ相代謝產(chǎn)物。其中M7(羥基化并脫二氫產(chǎn)物)和M8(M7進(jìn)一步脫氫產(chǎn)物)為首次報(bào)道的代謝產(chǎn)物。

3種不同性別人肝微粒體孵育體系檢測到的代謝產(chǎn)物種類一致，表明愛地那非在不同性別人群肝臟微粒體代謝過程中不存在代謝產(chǎn)物差異。由此推測，不同性別的人群對(duì)愛地那非的肝臟代謝過程一致，女性患者在服藥過程中，不會(huì)因肝微粒體代謝過程而增加未知副作用。人肝S9樣品中發(fā)現(xiàn)6種代謝產(chǎn)物，多為相對(duì)含量較高的代謝產(chǎn)物，推測這與人肝S9中酶成分較肝微粒體更為復(fù)雜，酶含量相對(duì)較低有關(guān)。

開展愛地那非的藥物代謝性別差異研究，可以幫助闡明藥物的毒副作用，對(duì)于藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)和藥物的安全性評(píng)價(jià)等研究具有重要意義，為新適應(yīng)證的開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持，同時(shí)為體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果外推至體內(nèi)試驗(yàn)提供了理論支持。