超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定梅花鹿茸中總游離氨基酸與游離氨基酸含量*

臧彬如，周改蓮，單國順，賈天柱，孟莉

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600；3.遼寧省中醫(yī)藥研究院，沈陽 110034)

鹿茸為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者習(xí)稱花鹿茸，后者習(xí)稱馬鹿茸，其味甘、咸，性溫，歸腎、肝經(jīng)，功效壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒，多用于治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿滑精、宮冷不孕、羸瘦、神疲、眩暈、耳鳴等證[1-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，氨基酸類成分是鹿茸有機(jī)成分中含量最高的營養(yǎng)物質(zhì)[5]，具有良好的營養(yǎng)支持和降血糖作用[6]。當(dāng)機(jī)體攝入鹿茸后，其中的蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)便可分解成小分子肽類和氨基酸以供機(jī)體吸收，從而使氨基酸發(fā)揮生物學(xué)活性[7]。梅花鹿茸中氨基酸類成分含量測定方法已有薄層掃描法[3]、高效液相色譜法[8]、氨基酸自動分析[9]等，但由于薄層掃描法用于定量的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和精密度較差，氨基酸自動分析法不能檢測脯氨酸且所用儀器復(fù)雜，價格較昂貴。同時，在實(shí)驗(yàn)前期通過液相色譜測定，分離效果差，抗干擾能力弱，準(zhǔn)確性不高[10]，且測定鹿茸中16種氨基酸類成分所用時間較長，多成分含量同時測定色譜條件摸索較困難復(fù)雜[11]，因此筆者在本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QqQ-MS/MS)技術(shù)建立梅花鹿茸中游離氨基酸的含量測定方法，與傳統(tǒng)氨基酸測定方法比較，該方法不僅準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，且專屬性強(qiáng)，在固有設(shè)備特點(diǎn)中相較其他檢測設(shè)備具有分析性能強(qiáng)、分析速度快、靈敏度高等特點(diǎn)[12]，可用于梅花鹿茸的質(zhì)量控制，為該藥材資源的綜合利用與開發(fā)提供參考依據(jù)[13]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ACQUITYTMUPLC I-Class系統(tǒng)，XEVO TQD型四極桿質(zhì)譜儀和MassLynx 4.0質(zhì)譜工作站軟件(美國Waters公司)，UV-T6型紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，F(xiàn)A1004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)；METTLER AE240型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)，RO-2640P超純水器。

1.2試藥 蛋氨酸(批號：DST180402-098)、脯氨酸(批號：DST170724-039)、谷氨酸(批號：DST180402-078)、組氨酸(批號：DST180719-069)、酪氨酸(批號：DST171013-261)、天冬氨酸(批號：DST180619-897)、賴氨酸(批號：DST170918-108)、異亮氨酸(批號：DST180619-899)、蘇氨酸(批號：DST180723-135)、精氨酸(批號：DST180519-079)、苯丙氨酸(批號：DST180623-898)、纈氨酸(批號：DST070505-061)、色氨酸(批號：DST180603-134)、絲氨酸(批號：DST180526-190)、亮氨酸(批號：DST180613-124)、谷氨酰胺(批號：DST180712-896)對照品均購于成都德思特生物技術(shù)有限公司，上述對照品經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)檢測，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>98%。茚三酮(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：D1111A)。市售梅花鹿茸樣品信息見表1，所有樣品均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為真品，均為鹿科動物梅花鹿Cervusnippon的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。水為超純水，由RO-2640P超純水器制備，乙腈、甲酸均為色譜純(德國Merck公司)，其余試劑均為分析純。

表1 市售梅花鹿茸樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1總游離氨基酸的含量測定

2.1.1對照品溶液的制備 精密量取干燥至恒重的色氨酸對照品約12.5 mg，置25 mL量瓶，加超純水稀釋并定容至刻度，得0.505 g·L-1對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 取梅花鹿茸樣品粉末(過三號篩，篩孔內(nèi)徑297 μm，下同)約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶，加70%乙醇10 mL，超聲提取60 min，放冷，濾過，濾液加70%乙醇定容于25 mL量瓶，混勻，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3線性關(guān)系考察 分別精密量取色氨酸對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置25 mL量瓶，分別用水補(bǔ)足1.0 mL，依次加入乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 值5.0)0.5 mL和3%茚三酮乙醇溶液0.5 mL，沸水浴加熱20 min，取出，冷卻至室溫，加50%異丙醇溶液定容至刻度，搖勻，570 nm波長處測定吸光度(A)。以色氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=1.305X-0.023 1(r=0.999 6)，線性范圍0.050 5～0.505 g·L-1。

2.1.4精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場)約1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，于570 nm波長處連續(xù)測定A值6次，計(jì)算得RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.1.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場)約1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，0.5，1.0，1.5，2 h后，按“2.1.3”項(xiàng)方法操作，于570 nm波長處測定A，計(jì)算得RSD為1.9%，表明供試品溶液在顯色后2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場)約1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法操作，于570 nm波長處測定A，計(jì)算得RSD 為3.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場)約0.5 g，共6份，精密稱定，分別加入色氨酸對照品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法操作，于570 nm波長處測定A，計(jì)算得平均加樣回收率為98.9%，RSD為2.1%，表明該方法回收率良好。

2.2游離氨基酸的含量測定

2.2.1色譜條件 ACQUITY BEH Amide色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，以20 mmol·L-1乙酸銨水溶液-含0.5%甲酸的乙腈溶液(15：85)為流動相A，含0.5%甲酸的20 mmol·L-1乙酸銨水溶液為流動相B，梯度洗脫(0～0.5 min，100%A；0.5～2.5 min，100%→96%A；2.5～3.5 min，96%→80%A，3.5～4 min，80%→62%A；4～6 min，62%→55%A；6～6.5 min，55%→100%A)；柱溫35 ℃；流速：0.6 mL·min-1；進(jìn)樣量1.5 μL。

2.2.2質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(electrospray ion source，ESI)，負(fù)離子模式采集，數(shù)據(jù)采集范圍m/z50～1000，毛細(xì)管電離電壓2.0 kV，脫溶劑氣溫度300 ℃，脫溶劑氣流量600 L·h-1，錐孔氣流量50 L·h-1，噴霧氣氮?dú)?N2)，采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(multimedia reaction monitoring mode，MRM)，詳細(xì)質(zhì)譜條件見表2。

2.2.3對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品溶液適量，以超純水溶解并定容于25 mL量瓶，搖勻，制成含絲氨酸0.053 mg·mL-1、脯氨酸0.051 mg·mL-1、纈氨酸0.058 mg·mL-1、蘇氨酸0.044 mg·mL-1、亮氨酸0.061 mg·mL-1、天冬氨酸0.059 mg·mL-1、谷氨酸0.048 mg·mL-1、賴氨酸0.05 mg·mL-1、組氨酸0.049 mg·mL-1、苯丙氨酸0.068 mg·mL-1、精氨酸0.046 mg·mL-1、酪氨酸0.055 mg·mL-1、色氨酸0.045 mg·mL-1、谷氨酰胺0.062 mg·mL-1、異亮氨酸0.047 mg·mL-1、蛋氨酸0.063 mg·mL-1、次黃嘌呤0.066 mg·mL-1的對照品儲備液，密封避光保存。

2.2.4供試品溶液的制備 取梅花鹿茸樣品粉末適量(過三號篩，篩孔內(nèi)徑297 μm)，精密稱取約1.0 g，置具塞錐形瓶，精密加入超純水20 mL，超聲提取10 min，9500 r·min-1離心10 min(r=13.5 cm)后取上清液，殘?jiān)映兯?0 mL繼續(xù)超聲提取，如此反復(fù)3次，合并上清液，加超純水定容于100 mL量瓶，混勻，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.5線性關(guān)系考察 分別精密量取各對照品儲備液適量，用超純水稀釋制得系列對照品溶液。按“2.2.1”及“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測定，以各對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。按信噪比(S/N)=3計(jì)算檢測限(limit of detection，LOD)，S/N=10計(jì)算定量限(limit of quantitation，LOQ)。結(jié)果表明各對照品質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，見表3和圖1。

表3 梅花鹿茸中16種游離氨基酸的線性范圍考察

1.組氨酸；2.精氨酸；3.絲氨酸；4.賴氨酸；5.谷氨酰胺；6.天冬氨酸；7.蘇氨酸；8.谷氨酸；9.脯氨酸；10.酪氨酸；11.纈氨酸；12.蛋氨酸；13.異亮氨酸；14.亮氨酸；15.苯丙氨酸；16.色氨酸。

Fig.1UPLC-MS/MSspectrumofmixedreferencesolution

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一濃度混合對照品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)條件連續(xù)測定6次，計(jì)算得16種氨基酸峰面積RSD為1.4%～4.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場)約1.0 g，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別在制備后0，2，4，8，12，24 h按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)條件測定，結(jié)果16種氨基酸峰面積RSD為2.5%～4.9%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場)約1.0 g，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)條件測定，結(jié)果16種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.8%～4.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取已知各氨基酸含量的梅花鹿茸樣品(西豐縣遼北種鹿場)約1.0 g，共9份，分別精密加入低(80%)、中(100%)、高(120%)3個水平對照品適量，每個水平3份，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)條件測定，結(jié)果16種氨基酸平均加樣回收率97.7%～99.8%，RSD為1.2%～2.6%。結(jié)果見表4。

2.3樣品測定 精密稱取15個廠家市售梅花鹿茸樣品，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)方法及儀器條件測定總氨基酸和16種游離氨基酸的含量，測定結(jié)果見表5和圖2～4。

3 討論

目前報道的梅花鹿鹿茸質(zhì)量控制方法包括紫外分光光度法[14]、紅外光譜法[15]、薄層色譜法[3]、高效液相色譜法[8]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]、氣相色譜法[17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18]及分子生物等多種技術(shù)。梅花鹿茸中常用于質(zhì)量控制的指標(biāo)有蛋白質(zhì)[19]、多糖[20]、氨基酸、多肽[21]等，其中氨基酸含量非常豐富[22]，且梅花鹿茸中的氨基酸可促進(jìn)人體蛋白質(zhì)合成，加快糖酵酶分解，提高人體造血能力?，F(xiàn)代研究表明，有關(guān)梅花鹿茸的研究主要集中在氨基酸含量測定方面，但采用的方法多為紫外分光光度法和色譜法[23]，不能較直觀地反映梅花鹿茸中氨基酸含量變化情況。UPLC-MS作為一種新的分析技術(shù)，其質(zhì)譜采用特定離子對掃描模式，樣品中雜質(zhì)不會對待測成分產(chǎn)生干擾，且克服了UPLC分離度差的問題，檢測信號高[24]，在短時間內(nèi)即可達(dá)到有效分離[25]，擁有更低的定量下限[26]，從而被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分析，更適合應(yīng)用于梅花鹿茸藥材質(zhì)量控制和綜合評價[27]。

表4 梅花鹿茸中16種游離氨基酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4 梅花鹿茸中16種游離氨基酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 市售梅花鹿茸樣品中總游離氨基酸及16種游離氨基酸的含量

圖2 主成分分析

圖3 偏最小二乘-判別分析

因此，筆者在本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-QqQ-MS/MS技術(shù)建立梅花鹿茸中游離氨基酸的含量測定方法，結(jié)果顯示該方法不僅操作簡單、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、分析效率高，且還可以明確各種氨基酸的含量情況，更有利于對梅花鹿茸的質(zhì)量進(jìn)行控制[28]。

3.1離子模式的選擇 氨基酸作為兩性化合物，其結(jié)構(gòu)中同時包含氨基及羧基。理論上，ESI源下的含氮化合物本身在正離子模式下容易離子化，而羧基結(jié)構(gòu)則更容易在負(fù)離子模式下進(jìn)行離子化。本研究中為了得到更高的離子化強(qiáng)度，分別考察了不同氨基酸在正負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹿茸中的16種氨基酸在負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度均強(qiáng)于正離子模式。

圖4 VIP得分圖

3.2色譜柱的選擇 由于氨基酸類化合物極性均較強(qiáng)，在反相C18色譜柱上多為弱保留，因而都很快隨流動相流出，無法得到良好的分離。因此，為更好地對氨基酸類成分進(jìn)行分離和分析，筆者采用反相Amide雜化硅膠鍵合相色譜柱，實(shí)現(xiàn)了對氨基酸類成分的良好分離。

3.3流動相的選擇 本實(shí)驗(yàn)前期研究中先后嘗試使用不同比例的甲酸水和甲酸乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，但由于色譜峰的拖尾現(xiàn)象較為嚴(yán)重，考慮到目標(biāo)化合物的極性特征。因此，在流動相中嘗試加入乙酸銨來改善色譜峰的峰形，結(jié)果取得滿意的效果。

3.4提取方式的選擇 梅花鹿茸樣品提取方法，筆者先后采用回流法和冷浸法，但上述兩種方法對氨基酸類物質(zhì)的提取效率均較低，且回流法所用時間較長，方法重復(fù)性較差。因此，筆者又嘗試了超聲提取法，結(jié)果方法的提取時間短，提取效率高，方法重現(xiàn)性好，適合作為梅花鹿茸樣品的提取方法。

筆者在本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-QqQ-MS/MS技術(shù)建立鹿茸中游離氨基酸的含量測定方法，并對15個廠家的市售梅花鹿茸樣品進(jìn)行含量測定[22]。結(jié)果顯示，不同廠家梅花鹿茸樣品中，氨基酸的組成和含量上均存在一定的差異。采用主成分分析(principal component analysis，PCA)，結(jié)果從PCA圖中可以看出梅花鹿茸樣品可分為兩類。其中，綠色部分為S2、S3、S4、S5、S6、S11和S12的梅花鹿茸樣品，紅色部分為S1、S7、S8、S9、S10、S13、S14和S15的梅花鹿茸樣品，結(jié)合數(shù)據(jù)分析可見，紅色部分為合格樣品，綠色部分為不合格樣品。進(jìn)一步采用偏最小二乘-判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，合格樣品與不合格樣品得到很好的分類，結(jié)合VIP得分圖中所示VIP值(選擇VIP值>1的成分作為起主要作用的成分)的情況可知，總游離氨基酸對梅花鹿茸的品質(zhì)影響最大，同時，賴氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和谷氨酸也對梅花鹿茸的品質(zhì)有一定的影響。這可能與不同產(chǎn)地梅花鹿茸的采收和加工方式有關(guān)。因此，有必要在以后的研究中對梅花鹿茸的炮制工藝做進(jìn)一步優(yōu)化，以保證梅花鹿茸飲片質(zhì)量的穩(wěn)定可靠。鑒于目前梅花鹿茸中的活性成分不明確，藥效機(jī)制不明晰，梅花鹿茸中活性成分的確定以及相關(guān)藥效機(jī)制的研究都值得進(jìn)一步研究。