UPLC-MS/MS測(cè)定魚肉中4種硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的方法研究

賴秀梅,李 亞，梁劍鋒，卓梅芳，黃 盈

(1.梧州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 梧州 543000；2.梧州學(xué)院 化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西 梧州 543002)

硝基呋喃類獸藥是在魚類養(yǎng)殖中曾經(jīng)使用的一種抗生素，其常用的有4種：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林[1-3]。硝基呋喃類藥物進(jìn)入魚體后會(huì)代謝，其相對(duì)的代謝產(chǎn)物分別為3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-2-乙內(nèi)酰(AHD)、氨基脲(SEM)，其由于與蛋白質(zhì)結(jié)合而相當(dāng)穩(wěn)定，所以目前通過檢測(cè)代謝物的殘留量，反映硝基呋喃類藥物的殘留狀況[4-7]。硝基呋喃類獸藥由于價(jià)格較低且效果好，所以在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)被廣泛用來治療魚類由大腸桿菌或沙門氏菌引起的腸炎、疥瘡、赤鰭病、潰瘍病等[8-10]。但是，研究發(fā)現(xiàn)硝基呋喃類藥物及其代謝物，對(duì)人體有致癌、致畸胎等嚴(yán)重的副作用，所以現(xiàn)行法律法規(guī)均禁止硝基呋喃類藥物在飼養(yǎng)過程中使用，并在動(dòng)物性食品中不得檢出，其相關(guān)限量見中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2002-12-24發(fā)布的公告第235號(hào)及于2005-10-28發(fā)布的公告第560號(hào)[10-12]。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)也在2010-03-22將硝基呋喃類藥物呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入可能違法添加的非食用物質(zhì)黑名單。在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規(guī)定動(dòng)物源性食品不得檢出硝基呋喃代謝物[13-15]。

雖然監(jiān)管部門在2006年發(fā)生“多寶魚獸藥殘留事件”后，對(duì)使用硝基呋喃類違禁獸藥行為進(jìn)行大力整治，但是從近年來水產(chǎn)品的國家食品安全抽檢中，魚中檢出硝基呋喃類違禁獸藥問題還是比較突出。2017年國家食品藥品監(jiān)督管理總局開展了經(jīng)營環(huán)節(jié)重點(diǎn)水產(chǎn)品專項(xiàng)檢查和抽樣檢驗(yàn)中，抽檢鮮活水產(chǎn)品808批次，檢出不合格樣品69批次，其中硝基呋喃代謝物不合格21批次[16]，占不合格總數(shù)的30.4%。在2016年經(jīng)營環(huán)節(jié)水產(chǎn)品專項(xiàng)檢查基礎(chǔ)上，國家食品藥品監(jiān)督管理總局在部分城市繼續(xù)組織開展了經(jīng)營環(huán)節(jié)鮮活水產(chǎn)品抽檢監(jiān)測(cè)，抽檢鮮活水產(chǎn)品607批次，檢出不合格樣品66批次，硝基呋喃代謝物不合格樣品16批次[17]，占不合格總數(shù)的24.2%。所以，從近年來國家食品安全監(jiān)管部門對(duì)水產(chǎn)品的監(jiān)督抽檢來分析，鮮活水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用硝基呋喃等禁用藥物的問題仍然比較突出。

目前檢測(cè)肉類中獸藥殘留常見的方法主要有：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1-2,8,10,18-20]、液相色譜法[21-23]、常規(guī)理化檢測(cè)法[24]、酶聯(lián)免疫法[25-27]、毛細(xì)管電泳法[28]等。食品分析實(shí)驗(yàn)室主要采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311—2007《動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》、GB/T 20752—2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定》，這2個(gè)國標(biāo)方法在樣品處理時(shí)均需要將乙酸乙酯萃取液提取并吹干、轉(zhuǎn)溶等實(shí)驗(yàn)步驟，且還需要將樣品過固相萃取柱凈化[29-30]，前處理步驟復(fù)雜，檢驗(yàn)成本高，基質(zhì)效應(yīng)干擾大。本研究簡化前處理操作，提高檢測(cè)效率，建立準(zhǔn)確、高效、快速的硝基呋喃代謝殘留量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：市售魚肉。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)：3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-2-乙內(nèi)酰(AHD)、氨基脲(SEM)，純度均大于99%,德國Dr.Ehrenstorfer公司；內(nèi)標(biāo)：AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SCA-HCl-13C,15N2，純度均大于99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

試劑：甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；正己烷，色譜純；甲酸，色譜純；鹽酸，分析純；鄰硝基苯甲醛，分析純；磷酸，分析純；氯化鈉，分析純；鹽酸溶液0.2 mol/L；衍生劑：稱取1.5 g鄰硝基苯甲醛，用甲醇溶解并定容到100 ml，現(xiàn)配現(xiàn)用；磷酸鉀溶液0.3 mol/L；氫氧化鈉溶液2.0 mol/L。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1樣品前處理

稱取2.00 g均質(zhì)魚肉樣品于50 ml離心管中，加入10 ml甲醇和水的混合溶劑(甲醇與水的體積比為1∶1)，漩渦10 min，在4 750 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄去上清液得固體沉淀，加入10.0 ml鹽酸溶液、100 μl鄰硝基苯甲醛衍生劑，再渦旋10 min，置于37℃水浴振蕩16 h。

在4 750 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，取全部上清液于50 ml離心管中，加入10 ml鹽酸溶液，2.0 ml磷酸鉀緩沖液，加入1.0 ml氫氧化鈉溶液，輕微搖勻，加入15 ml正己烷，搖勻，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心8 min。取下清液6.50 ml，到預(yù)先裝有4.0 g氯化鈉的離心管中，加入2.50 ml乙腈，上下振搖1 min，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心8 min，取上清液0.70 ml到2.0 ml離心管，再加入0.70 ml 0.1%甲酸水溶液，搖勻，15 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm濾膜，將濾液上機(jī)測(cè)試。

1.3.2液質(zhì)條件

1.3.2.1液相條件

色譜柱為ACE UltraCore C18柱(2.1 mm×75 mm,2.5 μm)，柱溫為35℃，流速0.35 ml/min，進(jìn)樣量1 μl，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.2.2質(zhì)譜條件

黃婉秋有一個(gè)由黃芪、黨參、川芎、當(dāng)歸、阿膠組成的養(yǎng)顏方，一吃就是40多年。這個(gè)養(yǎng)顏方已為許多人所推崇，影響甚廣。《中華醫(yī)藥》欄目曾在節(jié)目中公開了這個(gè)養(yǎng)顏秘方的內(nèi)容：

離子源為電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為正離子掃描(AJS ESI+)；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓3 500 V；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碎裂電壓以及碰撞能量見表2。

表2 硝基呋喃類獸藥殘留的代謝物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜的相關(guān)參數(shù)

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確配制0.1、0.4、0.8、1.6、2.0 ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含內(nèi)標(biāo)2 ng/ml)，經(jīng)過1.3.1節(jié)中衍生化、提取后，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)3次，所得到的峰面積與相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，與相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)。

1.3.4方法靈敏度

將適量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到空白魚肉中，采用1.3.1節(jié)前處理方法處理后，用LC-MS/MS檢測(cè)觀察目標(biāo)物質(zhì)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(RS/N)和對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度，RS/N>3者定為方法的檢測(cè)限。

1.3.5方法準(zhǔn)確度和精密度

在空白的魚肉中添加0.5、1.0、5.0 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后，然后按照上述方法進(jìn)行水解衍生，提取凈化后測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算，進(jìn)行驗(yàn)證方法的回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加量進(jìn)行5個(gè)樣品平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，同時(shí)采用國標(biāo)GB/T 21311—2007、GB/T 20752—2006兩個(gè)方法做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

取陽性魚肉樣品(檢出3-氨基-2-惡唑酮)，按照本試驗(yàn)方法進(jìn)行提取檢測(cè)，同時(shí)采用國標(biāo)GB/T 21311—2007、GB/T 20752—2006檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液中鹽酸濃度對(duì)目標(biāo)分析物水解影響

分別采用0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L鹽酸溶液對(duì)加標(biāo)樣品(添加0.8 μg/kg硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)物)進(jìn)行水解提取，其對(duì)應(yīng)硝基呋喃4種代謝物的相對(duì)響應(yīng)值見圖1。在0.05 mol/L鹽酸溶液時(shí)，樣品中硝基呋喃類代謝物只有部分目標(biāo)分析物水解，4種代謝物相對(duì)響應(yīng)值比較低，隨著鹽酸濃度增加，目標(biāo)分析水解相對(duì)響應(yīng)值隨之增大，在鹽酸濃度0.2 mol/L時(shí)，目標(biāo)分析物完全水解，相對(duì)響應(yīng)值達(dá)到最大，鹽酸濃度超過0.2 mol/L后，目標(biāo)分析物的水解出現(xiàn)抑制，相對(duì)響應(yīng)值出現(xiàn)了下降。所以試驗(yàn)方法中采用0.2 mol/L鹽酸濃度對(duì)樣品中目標(biāo)分析物水解比較合適。

圖1 不同鹽酸濃度對(duì)魚肉中硝基呋喃代謝物水解影響

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。硝基呋喃的代謝物AOZ、AMOZ、AHD、SEM在濃度0.1～2.0 ng/ml呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.990。

表3 硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性回歸情況

2.3 方法的靈敏度

按照1.3節(jié)的方法進(jìn)行處理，當(dāng)添加濃度為0.5 μg/kg時(shí)，測(cè)定目標(biāo)分析物AOZ、AMOZ、AHD、SEM的RS/N均大于3，該方法的檢出限為0.5 μg/kg。0.5 μg/kg添加樣品AOZ、AMOZ、AHD、SEM特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2。

圖2 AOZ、AMOZ、AHD、SEM特征離子質(zhì)量色譜圖

2.4 方法精密度

在空白魚肉中添加0.5、1.0、5.0 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行回收率試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)陽性魚肉樣品(檢出AOZ)進(jìn)行試驗(yàn)，采用本研究的檢測(cè)方法與國標(biāo)GB/T 21311—2007、GB/T 20752—2006兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表4～表6。

表4 魚肉中硝基呋喃類代謝物添加回收率檢測(cè)結(jié)果(n=5)

表5 國標(biāo)方法加標(biāo)回收率檢測(cè)結(jié)果(n=5)

表6 3種方法對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

由表4、表5可見，魚肉中硝基呋喃類代謝物在0.5～5.0 μg/kg，平均回收率為94.3%～96.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0%～4.5%(n=5)。與國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20752—2006、GB/T 21311—2007的方法加標(biāo)回收試驗(yàn)相比較，本方法在回收率指標(biāo)方面與國標(biāo)方法相近，但在方法相對(duì)偏差指標(biāo)上優(yōu)于國標(biāo)方法，這個(gè)可能與本方法減少了萃取液吹干轉(zhuǎn)溶、過固相萃取凈化柱等實(shí)驗(yàn)步驟有關(guān)，減少了樣品的損失，提高了方法精密度。該方法試驗(yàn)結(jié)果符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》對(duì)回收率和精密度的要求[31]。在對(duì)實(shí)際的陽性樣品(檢出AOZ)檢測(cè)中，本方法檢測(cè)結(jié)果與2個(gè)國標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，相對(duì)偏差均小于10%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。表明該方法對(duì)對(duì)魚肉中硝基呋喃類代謝物(AOZ、AMOZ、AHD、SEM)殘留提取、凈化、檢測(cè)是穩(wěn)定的，具有良好的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度和精密度。

3 討論

魚肉中硝基呋喃類代謝物國家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20752—2006、GB/T 21311—2007實(shí)用性比較好，但是存在方法重復(fù)性差、基質(zhì)效應(yīng)干擾大、檢測(cè)步驟復(fù)雜、成本高等不足。本方法基于液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)對(duì)魚肉中硝基呋喃類代謝物(AOZ、AMOZ、AHD、SEM)殘留進(jìn)行測(cè)定，主要優(yōu)化了前處理提取方法，簡化操作步驟：檢測(cè)過程中無需采用乙酸乙酯有機(jī)試劑萃取，無需將萃取液吹干轉(zhuǎn)溶，樣品提取液也無需要經(jīng)過固相萃取柱凈化。整個(gè)檢測(cè)方法可以大幅降低勞動(dòng)強(qiáng)度，縮減檢測(cè)時(shí)間，減少成本，且重復(fù)性好、檢出限低，能夠同時(shí)檢測(cè)魚肉中4種獸藥硝基呋喃類殘留，為魚肉中硝基呋喃類獸藥代謝物的檢測(cè)，提供了一個(gè)快速、簡單、低成本的可行檢測(cè)方法。該方法適合在大批量的農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)督抽檢中使用。