糧食中主要霉菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法建立

馮優(yōu)妍,楊愛馥,鄭秋月,萬 超,曹際娟，

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034； 2.大連海關(guān)，遼寧 大連 116001)

霉菌污染是糧食儲(chǔ)藏過程中尤為重要的危害原因，尤其產(chǎn)毒霉菌污染更為嚴(yán)重地影響糧食質(zhì)量安全。霉菌污染對(duì)糧食主要產(chǎn)生兩大方面的危害[1]:一是會(huì)引起糧食發(fā)生變質(zhì)，降低糧食的口感、營(yíng)養(yǎng)等食用價(jià)值，帶來經(jīng)濟(jì)上的巨大損失。二是霉菌毒素會(huì)危害人與動(dòng)物，威脅人類的身體健康。如一部分黃曲霉和所有的寄生曲霉在其代謝過程中會(huì)產(chǎn)生黃曲霉毒素，黃曲霉毒素具有致畸、致癌、致突變的作用，危害也最為嚴(yán)重[2-4]。

本研究設(shè)計(jì)TaqMan?實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)引物和探針，構(gòu)建優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，建立引發(fā)糧食霉變的黃曲霉和寄生曲霉霉菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法；并與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2582—2010中普通PCR法[5]進(jìn)行了比較，結(jié)果表明,實(shí)時(shí)熒光PCR方法快速、簡(jiǎn)便、易于觀察結(jié)果，為糧食霉變霉菌的早期快速準(zhǔn)確鑒別提供了有效技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微生物DNA快速提取劑(lysis buffer for microorganism to direct PCR)、Premix Ex Taq(Takara Code:RR390A)、Rox Peference DyeⅡ；引物及探針由寶生物工程(大連)有限公司合成、試驗(yàn)菌株來源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

表1 試驗(yàn)菌株及其編號(hào)

1.2 儀器與設(shè)備

Viia7熒光定量PCR儀，ABI公司；小型高速離心機(jī)，Eppendnorf公司；迷你離心機(jī)，Tomy公司；恒溫水浴鍋，Memmert公司；超微量紫外分光光度計(jì)，Eppendnorf公司。

1.3 引物與探針設(shè)計(jì)

根據(jù)黃曲霉和寄生曲霉共有的5.8SrDNA的ITS序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)通用引物和探針，并將設(shè)計(jì)好的引物和探針在GenBank上進(jìn)行blast比對(duì)確定引物和探針的理論特異性。引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物與探針序列見表2。

1.4 霉菌DNA的快速提取

(1)取50 μl微生物裂解緩沖液(lysis buffer for microorganism to direct)PCR 于滅菌的微型管(microtube)中。

(2)用滅菌牙簽或槍頭挑取單菌落，置于微型管(microtube)中攪動(dòng)幾下后取出。需要注意的是：牙簽置于微型管(microtube)中的時(shí)間不要過長(zhǎng)，否則會(huì)影響裂解液的體積，并會(huì)影響PCR擴(kuò)增效果。

(3)80℃熱變性15 min后，低速離心，取1～5 μl裂解后的上清液作為PCR反應(yīng)的模板。

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立

優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，得出最佳實(shí)時(shí)PCR通用反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

反應(yīng)體系總體積為25 μl，其中Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μl，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μl，探針(5 μmol/L)1 μl， Rox Peference DyeⅡ 0.5 μl，模板DNA(10～100 μg/ml)2 μl，滅菌雙蒸水8 μl。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s(1個(gè)循環(huán))；95℃變性5 s，60℃退火/延伸34 s(40個(gè)循環(huán))，熒光閾值為設(shè)備默認(rèn)值。

1.6 特異性試驗(yàn)

利用1.4節(jié)中的DNA提取方法提取黃曲霉、寄生曲霉、黑曲霉、雜色曲霉、正灰綠正青霉、白曲霉、赭曲霉和棒曲霉的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR擴(kuò)增，對(duì)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法進(jìn)行特異性測(cè)試。

1.7 靈敏度試驗(yàn)

以黃曲霉CGMCC3.4408為參考菌株進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，將菌株DNA提取液進(jìn)行10倍梯度稀釋，使DNA濃度為10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，確定所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度。

1.8 與SN/T 2582—2010中普通PCR方法比較

以平板計(jì)數(shù)方式為基準(zhǔn)，比較實(shí)時(shí)熒光PCR方法與SN/T 2582—2010中普通PCR方法檢測(cè)的靈敏度差異。

1.9 模擬污染樣品檢測(cè)

建立10個(gè)霉菌模擬污染糧食模型，分別將試驗(yàn)倉中的500 g糧食置于無菌環(huán)境中，用噴霧器向糧食表面均勻噴灑適量無菌水，混合均勻后用塑料薄膜密封，一周后分別采用GB 4789.16—2016[6]和實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行霉菌檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，黃曲霉、寄生霉菌均檢測(cè)到了特異性擴(kuò)增曲線，實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陽性。其它常見霉菌菌株的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

圖1 糧食中主要霉菌特異性檢測(cè)1.黑曲霉；2.雜色曲霉；3.正灰綠正青霉；4.白曲霉；5.黑曲霉；6.黃曲霉；7.黃曲霉；8.寄生曲霉；9.赭曲霉；10.棒曲霉

2.2 靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

(1)將黃曲霉CGMCC3.4408菌株的DNA提取液進(jìn)行10倍梯度稀釋，以DNA濃度10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl為模板進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，當(dāng)DNA濃度≥10-2ng/μl時(shí)可發(fā)生特異擴(kuò)增，說明黃曲霉CGMCC3.4408 DNA檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10-2ng/μl。

圖2 黃曲霉實(shí)時(shí)PCR靈敏度檢測(cè)1.10 ng/μl擴(kuò)增曲線；2.1 ng/μl擴(kuò)增曲線；3.10-1 ng/μl擴(kuò)增曲線；4.10-2 ng/μl擴(kuò)增曲線；5.10-3 ng/μl擴(kuò)增曲線；6.空白對(duì)照。

(2)取50 μl已復(fù)蘇的黃曲霉菌培養(yǎng)物，培養(yǎng)過夜后測(cè)其OD值，估計(jì)其菌數(shù)，然后按10-1、10-2、10-3CFU/ml，等倍數(shù)梯度稀釋，取幾個(gè)梯度的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，重復(fù)2次，取平均值確定其真實(shí)的菌密度。每個(gè)梯度菌液提取DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果比較，結(jié)果如表3所示，熒光PCR檢測(cè)靈敏度可達(dá)到76 CFU/ml。

表3 實(shí)時(shí)PCR與平板計(jì)數(shù)結(jié)果比較確定檢測(cè)靈敏度

2.3 與SN/T 2582—2010中普通PCR方法比較

以靈敏度測(cè)試中黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA稀釋液為模板，同時(shí)采用建立實(shí)時(shí)熒光PCR法和SN/T 2582—2010中普通PCR方法進(jìn)行方法檢出限比較。兩種檢測(cè)方法比較的結(jié)果如表4所示。

表4 實(shí)時(shí)熒光PCR法與SN/T 2582—2010中普通PCR法檢測(cè)結(jié)果的比較 ng/μl

由表4可見，建立實(shí)時(shí)熒光PCR法可檢測(cè)10-2ng/μl的霉菌，SN/T 2582—2010中普通PCR方法可檢測(cè)10-1ng/μl霉菌。實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)霉菌的靈敏度比SN/T 2582—2010中普通PCR法高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.4 在霉變玉米樣品檢測(cè)中的應(yīng)用

按照1.9節(jié)中的方法建立霉菌模擬污染糧食模型，用實(shí)時(shí)熒光PCR方法和GB 4789.16—2016方法同時(shí)檢測(cè)污染模型中分離得到的霉菌。采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)出2個(gè)樣品中存在黃曲霉和寄生曲霉菌，分離得到的陽性菌株同時(shí)采用GB 4789.16—2016方法進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)分離菌株為黃曲霉和寄生曲霉菌。驗(yàn)證結(jié)果表明，建立實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒定霉菌準(zhǔn)確度為100%，顯示該方法具有較好的適用性。

3 討論

本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR法可以特異性檢測(cè)糧食中黃曲霉和寄生曲霉菌。目前，國(guó)內(nèi)外糧食中主要霉菌檢測(cè)仍以傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)、生化鑒定為主。霉菌培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大，且霉菌孢子容易造成實(shí)驗(yàn)室污染，霉菌鑒定需要實(shí)驗(yàn)室人員豐富的經(jīng)驗(yàn)。本研究建立了糧食中黃曲霉和寄生曲霉實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法,與SN/T 2582—2010中普通PCR法和傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法相比較，驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光PCR方法的可靠性。與SN/T 2582—2010中普通PCR檢測(cè)方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在：(1)高靈敏度：實(shí)時(shí)熒光PCR法可檢測(cè)10-2ng/μl的霉菌，普通PCR方法可檢測(cè)10-1ng/μl霉菌；(2)操作簡(jiǎn)便，速度快，實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析一體化；(3)安全、無污染，實(shí)時(shí)熒光PCR在全封閉狀態(tài)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析，杜絕了SN/T 2582—2010中普通PCR開放檢測(cè)對(duì)環(huán)境的污染和由此導(dǎo)致的假陽性[7-8]。建立方法為我國(guó)糧食霉變監(jiān)測(cè)和快速檢測(cè)提供新的技術(shù)手段，可以快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)出糧食中是否帶有霉菌，早期識(shí)別霉變和病害發(fā)生，有效控制霉變和霉菌毒素產(chǎn)生發(fā)展，可提高糧食制品預(yù)防霉變病害和霉菌毒素污染發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測(cè)水平。