自噬在急性胰腺炎中的研究新進展

周佳，莫夢軍，劉蘇來，厲鷗，宋穎輝，彭創(chuàng)

（湖南師范大學附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科/湖南省膽道疾病防治臨床醫(yī)療技術研究中心，湖南 長沙410005）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種外分泌胰腺的炎癥性疾病，與組織損傷和壞死有關。目前，AP的全球發(fā)病率為34/100000，且在全世界范圍內呈上升趨勢。近年來，由于胰腺炎的準確診斷和合理治療，以及重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）患者的有效護理，AP相關病死率從1.6%下降到0.8%[1]。然而AP高發(fā)病率、復發(fā)率和長期并發(fā)癥仍然困擾著醫(yī)學界，給社會和醫(yī)療系統(tǒng)帶來額外的經濟負擔。所以對AP的發(fā)病機制及預防迫在眉睫；自噬在哺乳動物細胞中的生理和病理作用已被報道[2-4]。最近研究[5-7]表明，受損的自噬通量介導腺泡細胞空泡的形成和胰蛋白酶原的激活，導致AP的發(fā)生。因此自噬受損在AP的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，胰腺腺泡細胞自噬紊亂與AP的發(fā)生有關，自噬失調促進了AP的發(fā)展，這提示提高自噬效率的藥理學方法可能對治療AP具有重要意義。

1 自噬及其分子機制

自噬是細胞清除胞質中受損、缺陷或無用的細胞器、長壽命蛋白質和脂質，并回收其成分以滿足生物新陳代謝的營養(yǎng)和能量需要的主要分解代謝過程[8]。在研究細胞內吞的過程中，細胞外的物質首先進入吞噬小泡，然后吞噬小泡與溶酶體融合，產生一個被稱為吞噬-溶酶體的復合體，目標物在此復合體中降解[9]。而細胞內成分的降解過程則難以分析，Clark[10]首次通過觀察新生小鼠腎小管細胞，發(fā)現除了溶酶體外，還有形狀不規(guī)則的液泡，其中含有非晶態(tài)物質，偶爾也有線粒體，這是人們首次發(fā)現自噬的存在。1963年，De Duve[11]通過對溶酶體或液泡中細胞質成分的降解過程的觀察，發(fā)現并正式命名了“自噬”。自噬是一個多步驟、溶酶體驅動的降解過程，是一種在自噬相關基因（ATG）調控下通過溶酶體降解細胞內成分的高度保守、嚴格調控的細胞過程[12]。根據底物進入溶酶體途徑的不同，可將自噬分為大自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬[13-15]，一般情況下所說的自噬主要是指大自噬。在哺乳動物細胞中，自噬主要分為5個階段[15-16]，包括：(1) 吞噬細胞膜的誘導和成核；(2) 自噬體的延伸；(3) 自噬體關閉成熟；(4) 自噬體溶酶體融合；(5) 分解產物的降解。

自噬的形態(tài)學特征是隔離囊泡的形成，稱為自噬小體，而大部分自噬相關蛋白在囊泡形成的階段起作用[17]。研究[18-19]最初在酵母中發(fā)現了自噬機制的分子組成，之后在高等真核生物中發(fā)現了許多具有同源性的蛋白質。自噬相關基因（ATG）[20]在哺乳動物中有11個同源基因，其中有8個參與了兩個獨立又聯(lián)系的結合反應[21]。哺乳動物自噬的分子機制，尤其是分子、膜和信號級聯(lián)如何協(xié)同調控各個階段的具體機制尚不明確。Mercer等[22]分析了自噬的調控機制，從分子的角度對哺乳動物自噬體生物學變化過程進行了詳細的闡述。

與自噬的調控密切相關的物質，簡單來說分為絲氨酸/蘇氨酸復合物（ULK1/2）、III類磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K/PI3K）復合物（PIK3C3/VPS34，Beclin 1）、III類磷脂酰肌3-激酶效應器（PtdIns3P）、WIPI蛋白質和兩種泛素類復合物（ATG12-ATG5-ATG16L1，LC3/ATG8）以及跨膜自噬相關蛋白ATG9[23]。自噬的過程是由自噬相關蛋白（ATG）的分級招募復合物介導，起始受unc-51樣激酶（ULK1；酵母中為ATG1）介導，作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），然后形成另一個包含III類磷脂酰肌醇3-激酶復合物（PIK3C3/VPS34和Beclin1蛋白），作為吞噬泡核心。

吞噬泡招募的WIPI2蛋白，與類似泛素E3的復合體ATG12-ATG5-ATG16L1相連接[24]，吞噬泡形成過程的最主要特征是通過ULK復合體和AMPK（腺苷酸活化蛋白激酶）的途徑的調控來實現。在自噬誘導過程中，mTOR與ULK1復合物解離，導致其去磷酸化，從而激活自噬[25]。AMPK通過直接或間接使ULK1磷酸化的方式來激活自噬[24]（圖1）ULK1活性的關鍵靶點受III類磷脂酰肌醇3-激酶復合物（PI3K）調控，包括Beclin-1（ATG6）和VPS34[26]。自噬調控的條途徑包括mTOR途徑，Atg 6/Beclin-1 調控途徑以及兩個泛素樣結合過程途徑[27-28]。自噬的主要調節(jié)因子是雷帕霉素，mTOR作為自噬誘導的上游機制靶點，感知細胞營養(yǎng)水平，調節(jié)細胞生長和存活，直接抑制自噬。雷帕霉素是mTOR的特異性抑制劑，沉默或抑制mTOR激酶的活性可以增強自噬作用已達到調控自噬的目的，為疾病的治療提供新的策略。

2 自噬在AP 中的作用

圖1 哺乳動物細胞自噬的基本過程和相關途徑Figure 1 Basic process and relevant pathways of autophagy in the mammalian cells

胰腺腺泡細胞的主要生理功能是合成、運輸、儲存和分泌消化酶。它依賴于內質網（ER）、線粒體和內溶酶體自噬系統(tǒng)在內的腺泡細胞器的正常功能。近年來的研究[29]表明，這些細胞器的功能在胰腺炎中紊亂，并為AP的發(fā)生機制奠定了基礎。目前已經明確，溶酶體和胰蛋白酶原部分在細胞器中共區(qū)域化，是一個腺泡細胞自噬的過程[5,30-32]。在胰腺炎早期觸發(fā)這種自噬反應的確切機制尚不清楚，目前認為病理性鈣信號是自噬發(fā)生前的關鍵事件[5,30]，也可能是抑制酶原異常積累的腺泡細胞分泌的機制。自噬通過維持高蛋白質合成率和防止內質網應激、DNA損傷在胰腺腺泡細胞中發(fā)揮重要生理作用[33]。反之，自噬受損會使胰腺功能的逐漸喪失，從而導致胰腺炎的發(fā)展[33]。Biczo等[9]在多種AP動物模型中發(fā)現，線粒體功能障礙和自噬受損在AP的發(fā)展過程中發(fā)揮著核心作用。因此，異常自噬在胰腺炎中發(fā)揮重要作用。

2.1 AP 中自噬體的積累

在30年前，研究者[34]從人類AP標本中首次觀察到自噬性液泡的積累和大量腺泡細胞的破壞。細胞質空泡化是胰腺炎組織損傷的早期表現，與腺泡細胞中酶原顆粒的改變和自噬體的形成有關[34]。過去幾年內，越來越多的證據表明這種病理空泡化反映了自噬體的積累[32,35]。在溶酶體中自噬物質被降解之前，自噬體依賴溶酶體相關膜蛋白2（LAMP-2）與溶酶體融合形成自噬溶酶體[36]。自噬流的阻斷表現為自噬蛋白降解減少和溶酶體標記物的積累（如Rab7和LAMP-2）。自噬蛋白降解減少與腺泡細胞中LC3的積累增加、溶酶體清除效率低下等有關。然而，研究數據顯示，導致胰腺炎病理表現的并不是自噬本身，而是其損傷[5-6]，這在前文已有論述。自噬流受損和自噬體在腺泡細胞中的積累導致腺泡細胞空泡化和腺泡內胰蛋白酶積累，這是AP的關鍵病理反應。

2.2 自噬與溶酶體

自噬開始于自噬物質的隔離，然后與溶酶體融合形成自噬-溶酶體復合體，最終被溶酶體水解酶降解[37]。由此可見，自噬是一個溶酶體介導的過程，細胞通過這個過程降解和回收胞內物質。自噬的進展取決于溶酶體的功能，即溶酶體與自噬體的正確融合和高效的溶酶體蛋白水解活性。生理激活的自噬既需要誘導自噬體形成，也需要溶酶體降解介導的高效自噬流[36]。LAMP-2是一種普遍存在的溶酶體膜蛋白，在正常的人胰腺組織中高表達[38]，在自噬過程的后期，溶酶體與自噬體的適當融合需要LAMP-2[39]，有實驗[40]通過敲除LAMP-2蛋白抑制自噬體-溶酶體融合，阻止自噬體的轉化來觸發(fā)自噬體的積累。Fortunato等[41]通過對酒精性AP大鼠注射脂多糖試驗證實急性壞死性胰腺炎（ANP）會導致LAMP-2的耗盡，腺泡細胞內大量空泡積累。筆者認為胰腺炎的腺泡細胞空泡化是由LAMP-2的耗竭介導的，而LAMP-2的耗竭反過來又促進了自噬體的積累[40]，因此溶酶體蛋白LAMP-2的缺失可能通過影響自噬在AP的發(fā)病機制中起關鍵作用。自噬體的積累可能涉及溶酶體系統(tǒng)的普遍衰竭，這強調了溶酶體缺陷對胰腺炎中自噬的影響。

2.3 自噬與線粒體

自噬的過程需要多種細胞器的參與，線粒體通過產生ATP參與各項生理活動[42]，線粒體功能障礙導致自噬受損、內質網應激和脂質代謝紊亂，進而導致AP[43]。線粒體膜通透性是引起細胞凋亡和壞死的普遍機制，它是由線粒體通透性轉換孔（MPT）的持續(xù)開放介導的，MPT是一種穿過內外線粒體膜的多蛋白非特異性通道[44-45]，主要為線粒體常駐蛋白親環(huán)素D（CypD）組織，可被遺傳、分子或藥物抑制，阻斷MPT的開放可防止線粒體衰竭和壞死。在MPT“開放”狀態(tài)，其允許外界溶質（包括水）無限度地進入線粒體基質，使線粒體去極化，從而抑制線粒體合成ATP，導致細胞功能喪失和壞死。值得注意的是，AP中線粒體去極化顯著激活自噬，特別是線粒體自噬[46]，而線粒體功能障礙后無法合成ATP，進一步促進自噬誘導。MPT與AP有直接關系，若通過基因沉默來抑制不同AP中腺泡細胞中的MPT相關蛋白后，相應的炎癥、自噬水平、免疫應答水平會下降[47]。線粒體和溶酶體功能障礙相互增強，共同造成的自噬流受損，進而導致AP（圖2）。

圖2 AP 中線粒體和溶酶體功能異常相互增強，促進自噬受損Figure 2 Interaction enhanced dysfunction of the mitochondrion and lysosome promoting autophagy damage in AP

2.4 高遷移率族蛋白HMGB1 參與AP 的自噬

HMGB1是一種普遍存在的核蛋白它調節(jié)和促進多種DNA活動，如轉錄、復制、重組和修復。有研究[48]報道小鼠胚胎成纖維細胞細胞核內HMGB1轉移至細胞質后，HMGB1蛋白A-box的C 23、C 45 位點以二硫橋的形式直接與自噬因子BECN1結合，推動BECN1與凋亡抑制因子Bcl-2分離，通過促進BECN1和III 型磷酸肌醇3 激酶（PI3K Class III）/Vsp34結合，激活自噬。此外，HMGB1與RAGE結合可以激活細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）。激活的ERK可以激活死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK），使BECN1磷酸化，促使BECN1與Bcl-2分離，從而調節(jié)細胞自噬水平[49]。在AP 的患者和動物模型中，血清HMGB1水平顯著升高，并與疾病的嚴重程度呈正相關[50-51]，抑制HMGB1的釋放或細胞因子活性可對胰腺炎實驗模型產生保護作用[52]。在胰腺細胞核中，HMGB1在許多基因的轉錄中發(fā)揮作用，這些基因對自噬過程至關重要[53-54]。AP中HMBG1參與ANP相關的自噬[55-56]。有研究[57]通過對大鼠ANP模型的HMGB1檢測，顯示HMGB1最初在細胞核中增加，可能導致自噬的啟動，隨后轉運到細胞質中，與BECN1相互作用，增強自噬，最后HMGB1釋放到血液中，導致A N P 惡化。因此，細胞HMGB1的水平與AP的自噬有著密切的關系，可以通過檢測并其表達水平來評估AP的嚴重程度進而采取針對性的治療方式以延緩AP進展，而其具體機制還需進一步研究。

3 阻斷異常自噬水平在轉變SAP 進展期的應用

自噬流受損是AP早期的一個特征，自噬通量的積累可以通過激活氧化應激和核因子κB（NF-κB）通路從而加重疾病的過程。AP的自噬為一種異常自噬，隨著自噬程度的增加，炎癥水平增加，導致病情加重。前期研究已經證明了自噬在胰腺炎發(fā)展中的重要作用，然而從自噬的角度對AP 病情的改善上的探討還較少。自噬的信號通路是自噬過程的重要微觀機制，通過對信號傳遞靶點蛋白的激活或抑制，可對自噬進行調節(jié)。近期一項抑制BRD4（含溴域蛋白4）通過恢復受損的自噬通量對AP 具有保護作用的研究證實了自噬通量的調控對胰腺炎治療的可行性[58]。另一項利用蛙皮素誘導的大鼠模型顯示，苦參苷II可通過影響N F-κ B 依賴的自噬對胰腺炎重癥急性期的大鼠有保護作用，苦參II通過抑制NF-κB、TNF-α、SIRT1的表達和減少SIRT1-脫乙?；腖C3來降低SAP的自噬活動[59]。自噬通量受損和自噬體在腺泡細胞中的積累介導了AP的兩個關鍵病理反應：腺泡細胞空泡化和腺泡內胰蛋白酶積累，提高或降低自噬通量，是影響胰腺炎病程發(fā)展的關鍵機制。研究[60]運用Resolvin D1（一種內源性脂質介質）保護胰腺，通過恢復自噬通量來解決實驗性AP的炎癥，Resolvin D1降低了自噬空泡的數量和自噬相關標志物的表達，使AP模型炎癥程度及炎癥細胞因子水平降低。同時有研究利用大黃素對大鼠AP模型中自噬反應的影響，使自噬相關蛋白基因LC3B、beclin-1和p62的轉錄水平降低，自噬空泡的大小和數量均下降，AP的嚴重程度得到改善[61]。還有其他研究也證明了自噬通量調控對于減緩AP發(fā)展的作用。Piplani等[62]在AP小鼠模型中，發(fā)現了辛伐他汀通過提高自噬通量以防止胰腺細胞損傷。通過調控自噬通量來防止胰腺細胞損傷，進而減緩AP的發(fā)展進程。Wan等[63]通過小鼠模型探討AP發(fā)病后調節(jié)自噬的治療作用的研究中發(fā)現自噬的調節(jié)可以改變L-精氨酸或蛙皮素加LPS誘導的小鼠AP的進展，這進一步驗證了調節(jié)自噬對治療胰腺炎的重要。最新的研究闡述了番茄紅素可通過防止胰腺腺泡細胞自噬受損減輕AP的嚴重程度[64]，番茄紅素通過自噬作用減弱胰腺炎病理的可能機制，為胰腺炎的新型治療提供了重要的見解。這些研究結果表明，自噬受損在AP的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，提高自噬效率可能對治療AP具有重要意義。

總之，AP的進展可以通過調控自噬而阻斷，可能為臨床AP治療提供特異性的治療方案。正因為自噬貫穿AP的始終，自噬的調節(jié)如自噬流通量的提高、阻斷異常自噬等可以緩解及縮短AP的進程，對臨床預防和治療AP的進展具有重要意義。

4 思考與展望

在精氨酸、蛙皮素等誘導的多種AP模型中，自噬功能存在明顯異常，因此，自噬可以視為多種因素導致胰腺損傷的的最終共同通路之一。從動物模型多角度驗證預防和治療AP，對傳統(tǒng)的胰腺炎胰蛋白酶中心理論提出了挑戰(zhàn)。在AP 的發(fā)病前，自噬流的異常和細胞內多種機制的失調，參與了胰腺細胞的壞死及胰酶的細胞內激活，腺泡細胞自噬損傷引起酶原顆粒堆積和AP。在胰酶激活與AP 之間，自噬異常是其中的重要一環(huán)，通過調控自噬可以讓胰腺炎小鼠模型的進展得到改善，這充分證明了自噬對于治療胰腺炎的重要性。目前，自噬與胰酶異常激活的調節(jié)關系已成為AP研究領域的熱點，已有相關結果表明，自噬與氧化應激、炎癥及免疫功能障礙等AP 其他發(fā)病機制間存在重要紐帶關系[65]。AP中自噬起到了重要的作用，例如信號傳遞靶點蛋白的激活、自噬流的阻斷，其中自噬流受阻是AP發(fā)展為SAP的重要病理機制。因此，需要對自噬分子機制及信號通路的進一步理解，通過對信號通路相關蛋白的調控來調控自噬流，延緩甚至逆轉AP的發(fā)展病程，為AP的高效診治提供更多思路。