胰腺星狀細胞活躍度在胰十二指腸切除術(shù)后胰瘺中的預測價值

曹昕彤，朱帥，羅庚求，林嘉晏，寧彩虹，李嘉榮，申鼎成，王曦滔，黃耿文

（中南大學湘雅醫(yī)院 1.普通外科 2.胰腺外科 3.病理科，湖南 長沙 410008）

隨著外科技術(shù)的提高以及圍術(shù)期管理的日趨完善，胰十二指腸切除術(shù)（pancreaticoduodenectomy，PD）的病死率已降至5%以下，但術(shù)后胰瘺（postoperative pancreatic fistula，POPF）的發(fā)生率仍高達20%～40%[1-4]，嚴重影響患者的術(shù)后恢復，甚至影響遠期生存率。研究[5]表明，質(zhì)軟胰腺是發(fā)生POPF的重要的危險因素之一。然而，胰腺質(zhì)地的判斷往往憑借醫(yī)生的主觀感受，缺乏客觀的評價依據(jù)。胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells，PSC）與胰腺的纖維化密切相關[6-7]。PSC的活躍度能否用來預測POPF，目前尚無研究報道。本研究前瞻性收集中南大學湘雅醫(yī)院2017年 12月—2019年9月間101例PD術(shù)患者資料，通過分析胰腺切緣組織中PSC的活躍度，探討PSC的活躍度在PD術(shù)后POPF中的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性收集2017年12月—2019年9月間中南大學湘雅醫(yī)院連續(xù)收治的101例行PD術(shù)的患者，其中男55例（54.5%），女46例（45.5%）；年 齡27 ～81歲，中位年齡56 歲；開腹手術(shù)96例（95.0%），腹腔鏡手術(shù)5例（5.0%）；經(jīng)典PD 95例（94.0%），保留幽門的PD（pyloruspreserving PD，PPPD）6例（6.0%）；病理類型包括十二指腸乳頭癌36例（35.6%），胰腺癌 28例（27.6%），膽總管下段癌11例（10.8%），胰腺囊性腫瘤7例（7.0%），壺腹癌6例（6.0%），慢性胰腺炎6例（6.0%），十二指腸或胰腺間葉源性腫瘤5例（5.0%），胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤1例（1.0%），膽總管炎性狹窄1例（1.0%）。

1.2 染色方法及PSC 活躍度分級

取PD 手術(shù)中胰腺頸部切緣處胰腺組織行α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫組化染色。取該處胰腺組織石蠟塊予以切片、脫蠟后，將其置于檸檬酸鈉緩沖溶液（0.01 mol/L，pH6.0）中高壓環(huán)境（125 ℃， 131 kPa）約15 min以修復抗原。3%H2O2溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。一抗（鼠抗人單克隆平滑肌肌動蛋白抗體1A4，稀釋濃度1∶50），濕盒持續(xù)4 ℃孵育過夜。二抗（羊抗鼠單克隆抗體）濕盒孵育，在4 ℃下放置約20～30 min，二氨基聯(lián)苯胺和蘇木精分別進行顯色和復染，完成染色。

參考Tanaka等[8]的分級方法，由胰腺病理專家盲法閱片，將α-SMA 免疫組化染色強度分為陰性（-）、弱陽性（+）、中陽性（++）和強陽性（+++）4個等級，分別對應0級（S0）、1級（S1）、2級（S2）、3級（S3）對PSC活躍度進行量化，其具體評判細則如表1所示。

表1 PSC 活躍度的分級標準Table 1 The grading criteria for PSC activity

本研究中所有的臨床數(shù)據(jù)、標本的收集均獲得患者的知情同意，并簽署書面同意書。本研究獲得中南大學湘雅醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準進行（項目編號：201707777）。

1.3 圍術(shù)期管理

術(shù)后常規(guī)預防性使用抗生素以及營養(yǎng)支持等治療。PD患者術(shù)后的腹腔引流管均采用延遲性拔管策略（留置時間≥7 d），并常規(guī)于術(shù)后第1、3、7天動態(tài)監(jiān)測腹腔引流液淀粉酶（drainage fluid amylase，DFA）情況。對于術(shù)后7 d或以后的DFA處于正常范圍，且引流管引流量＜10 m L/d 的患者，考慮拔除腹腔引流管。所有患者均采取快速康復外科模式促進患者早期恢復[9]。

1.4 POPF 的定義及診斷標準

臨床相關性胰瘺（clinically relevant POPF，C R-POPF）的診斷標準參照2016年版胰腺外科國際研究小組[10]（International Study Group of Pancreatic Surgery，ISGPS）的定義：術(shù)后＞3 d時，DFA大于血清淀粉酶正常值上限的3倍，且與臨床治療及預后相關。在此前提下，僅包括B級和C級CR-POPF，而生化漏（biochemical leakage）不包括在內(nèi)。生化漏：僅術(shù)后第3天或以后腹腔引流液淀粉酶升高達正常值上限3倍，而對臨床結(jié)局無任何影響。B級CR-POPF：(1) 腹腔引流管留置時間＞3周；(2) POPF相關性臨床治療方案變更（加用生長抑素、抗生素升級、腸內(nèi)外營養(yǎng)支持、輸血等）；(3) 需經(jīng)皮或內(nèi)鏡下穿刺引流的POPF繼發(fā)性胰周積液；(4) 需血管造影介入止血的POPF相關性出血；(5) POPF繼發(fā)性感染，但無臟器功能衰竭。滿足以上5種情況中的任意1種。C級CRPOPF：(1) 需再次開放手術(shù)處理的POPF相關并發(fā)癥（如假性動脈瘤破裂出血、腹腔膿腫形成、吻合口破裂等）；(2) POPF繼發(fā)性器官功能衰竭；(3) POPF相關性死亡。滿足以上3種情況中的任意 1種。

1.5 統(tǒng)計學處理

計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，其比較采用χ2檢驗；計量資料中符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，其比較采用t檢驗；符合偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）表示，其比較采用Mann-WhitneyU檢驗。多因素分析采用Logistic回歸模型，并應用受試者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）進行分析。以上均通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)結(jié)果

全組101例患者中，41例術(shù)后出現(xiàn)CR-POPF，CR-POPF發(fā)生率為40.6%，包括B級36例，C 級 5例。無CR-POPF者共60例，包括19例生化漏和41例無胰瘺者。中位手術(shù)時長與術(shù)中出血量分別為340 min和400 mL。術(shù)后總的并發(fā)癥率為46.5%（47/101），除C R-POPF 外，包括術(shù)后膽汁漏 7例（7.0%），延遲性胃排空障礙4例（4.0%），術(shù)后出血（包括消化道出血和腹腔內(nèi)出血）16例（15.8%）和肺部并發(fā)癥（包括胸腔積液、肺部感染、肺不張及呼吸功能衰竭等）46例（45.5%）。術(shù)后中位住院時長為15 d，再入院率為6.0%（6/101），術(shù)后90 d內(nèi)病死率為4.0%（4/101）。

2.2 PSC 活躍度分級

本研究中，切緣處胰腺免疫組化染色的鏡下表現(xiàn)及分級如圖1 所示。依照評判規(guī)則，全組被分級為S0、S1、S2、S3的病例分別為9、49、24、19例，各活躍度等級中的CR-POPF率分別為88.9%（8/9）、57.1%（28/49）、16.7%（4/24）和5.3%（1/19） ，呈逐漸遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。PSC等級與胰腺質(zhì)地之間的關系如表2所示。在不同的胰腺質(zhì)地之間，PSC等級的分布具有明顯差異性（P＜0.001）。其中，在柔軟胰腺中占比最高的PSC等級為S1（60.6%），而在質(zhì)硬胰腺中為S2（40.0%）。經(jīng)Spearman相關性檢驗結(jié)果顯示，PSC活躍度與胰腺質(zhì)地的硬度之間存在明顯正相關性（r=0.456，P＜0.001），而與CR-POPF之間則存在明顯負相關性（r=-0.539，P＜0.001）。

圖1 α-SMA 免疫組化染色所反映的PSC 的活躍度 A：S0；B：S1；C：S2；D：S3Figure 1 The PSC activity shown by immunohistochemical staining of α-SMA A: S0; B: S1; C: S2; D: S3

表2 PSC 等級與胰腺質(zhì)地之間的關系[n（%）]Table 2 Relationship between the PSC activity grade and pancreatic texture [n (%)]

2.3 臨床病理因素與CR-POPF 關系的單因素和多元回歸分析

單因素分析顯示，胰腺質(zhì)地、腫塊病理、PSC活躍度分級、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、胰管直徑、術(shù)前總膽紅素、術(shù)后第1 天引流液中淀粉酶含量（DFA1）均與CR-POPF的發(fā)生有關（均P＜0.05）（表3）。多元回歸分析顯示，僅PSC活躍度分級（OR=0.24，95%CI=0.10～0.56，P＜0.001）和術(shù)前總膽紅素水平（OR=1.01，95%CI=1.00～1.01，P=0.008）是預測CR-POPF的獨立危險因素（表4）。

2.4 PSC 活躍度分級對CR-POPF 的預測價值

PSC活躍度分級預測CR-POPF的ROC曲線如圖2 所示。當截斷值取1.5 時，其曲線下面積（area under curve，AUC）為0.795（95%CI=0.708～0.881），相應的敏感度和特異度分別為63.3%和87.8%，提示其對CR-POPF具有良好的預測價值。

表3 臨床病理因素與CR-POPF 關系的單因素分析Table 3 Univariate analysis of relationship between clinicopathologic factors and CR-POPF

表4 臨床病理因素與CR-POPF 關系多因素Logistic 回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of relationship between clinicopathologic factors and CR-POPF

3 討 論

圖2 PSC 等級預測PD 術(shù)后CR-POPF 的ROC 曲線Figure 2 ROC curve of PSC activity for predicting CR-POPF following PD

POPF是PD術(shù)后的嚴重并發(fā)癥之一，可繼發(fā)引起術(shù)后出血、腹腔感染、延遲性胃排空障礙等一系列并發(fā)癥，甚至導致患者死亡[11-15]。胰腺質(zhì)地與POPF的發(fā)生密切相關[5,16]。然而，僅靠外科醫(yī)生的觸感判斷胰腺質(zhì)地較為主觀。因此，國內(nèi)外均有研究采用其它較為客觀的方法來評判胰腺質(zhì)地，如MRI、胰腺彈力儀等，取得一定效果，但實用性不高[17-21]。PSC作為胰腺實質(zhì)中的基質(zhì)細胞，活化后可分泌大量纖維組織，從而參與胰腺組織的纖維化，理論上可能與胰腺質(zhì)地變硬密切相關[6-7,21-22]。本研究采用免疫組化檢測胰腺切緣組織中的α-SMA蛋白反映PSC的活躍度，前瞻性研究101例PD患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)PSC活躍度是預測CR-POPF的獨立危險因素（OR=0.24，95%CI=0.10～0.56，P＜0.001）。此外，ROC曲線分析顯示PSC活躍度的預測效能良好（AUC=0.795），從而進一步證實 PSC活躍度是預測PD術(shù)后胰瘺的重要的客觀指標。

PSC是一種外形類似星形的胰腺基質(zhì)細胞，最初于1998年被發(fā)現(xiàn)并分離培養(yǎng)[23-24]。它存在于胰腺腺泡細胞、微血管及微胰管周圍。在大多數(shù)情況下，PSC處于靜止態(tài)，具有免疫調(diào)節(jié)、吞噬、儲存脂質(zhì)、維持胰腺組織基礎內(nèi)外分泌以及其基本結(jié)構(gòu)等功能[25-26]。然而，在缺氧、酒精、吸煙等惡劣條件刺激下，PSC可轉(zhuǎn)為活化態(tài)并獲得成纖維細胞樣表型[27-30]，分泌大量細胞因子（如TNF-α，TGF-β、PDGF等）以及細胞外基質(zhì)，促進胰腺組織的纖維化進程[7,31]。較為特殊的是，慢性胰腺炎的胰腺組織中有大量單核細胞浸潤，后者通過產(chǎn)生TNF-α促進PSC活化[32]；胰腺癌細胞與PSC存在纖維化/缺氧循環(huán)機制[33]，通過正反饋放大作用致使組織持續(xù)性的缺氧、缺血、纖維化。以上可能是PSC介導胰腺纖維化的主要機制。然而，其更具體的分子信號通路仍有待于進一步探究。

從組織病理學角度來看，胰腺質(zhì)地取決于組織中的纖維化程度，它與胰腺的外分泌功能呈負相關性[22,34]。然而究其根本，胰腺纖維組織的蓄積是PSC活躍的結(jié)果，故后者更能反映胰腺質(zhì)地變化的本質(zhì)。遺憾的是，目前的研究主要集中于探索胰腺纖維化與胰瘺的聯(lián)系[35-37]，而鮮有關于PSC活躍度和POPF關聯(lián)性的研究。Erkan等[38]認為胰腺癌中的PSC是導致胰腺纖維化的主要原因，可影響外科醫(yī)生對質(zhì)地的判斷。Tanaka等[8]通過將不同活躍程度的PSC進行分級并對CR-POPF進行預測，率先證實PSC等級在發(fā)生POPF與無POPF的患者之間存在統(tǒng)計學差異（P=0.035）。在此基礎上，本研究發(fā)現(xiàn)隨著PSC活躍度提高，CR-POPF率明顯降低，這與前述的理論基本契合。而且，在本研究中，PSC活躍度被證實是發(fā)生CR-POPF的獨立危險因素，而胰腺質(zhì)地并不是獨立的危險因素，從而證實了PSC活躍度在預測CR-POPF方面更具有客觀性與優(yōu)越性。因此，PSC活躍度可代替胰腺質(zhì)地，作為評估CR-POPF風險的全新預測指標。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究所涵蓋的樣本量不大，且為單中心研究；其次，PSC活躍時分泌或活化的蛋白種類繁多，其特征性蛋白除α-SMA外[39]，還包括成纖維細胞活化蛋白-α，潛在轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合蛋白等[40-41]。本研究中的標記蛋白較為單一，其客觀度稍顯不足，有待于在今后的實驗中予以完善。

綜上所述，PSC的活躍度對CR-POPF的預測具有重要意義，可作為臨床指導預測CR-POPF發(fā)生的重要參考指標之一。