中藥白芨/聚乙烯醇納米靜電紡絲膜的制備和生物相容性評價

謝曉峰，周寒璞，趙聰，梁優(yōu)，王芳，黃建平，奉典旭

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 普外科，上海 200021，2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 普外科，上海200062）

創(chuàng)面愈合和組織修復(fù)一直是外科醫(yī)師無法回避的問題，在醫(yī)學(xué)發(fā)展的過程中得到不斷完善和進(jìn)步。尋求組織相容性好、植入或覆蓋創(chuàng)面無不良反應(yīng)、可治療或替代機體中缺損組織、促進(jìn)愈合的創(chuàng)傷修復(fù)材料，始終是外科領(lǐng)域研究的焦點之一。中藥外用促進(jìn)創(chuàng)面愈合和組織修復(fù)的歷史悠久，療效獨特。白芨（Bletilla striata，BS）為蘭科植物白芨的干燥塊莖，別名良姜、紫蘭，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，1963年后收載于各版藥典，具有補肺、止血、消腫、生肌、斂瘡的功效[1]，素有“必澀而收，入肺止血，生肌治瘡，外科最善”之稱[2]。白芨在臨床上能促進(jìn)傷口愈合，加速組織重建[3-4]。近年，通過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究進(jìn)一步確切證實，其有效成分具有提高創(chuàng)面組織中巨噬細(xì)胞、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附生長的功能，能顯著提高細(xì)胞的增殖能力[5]，同時還有抑菌止血的功能[6]。靜電紡絲（electrostatic spinning）技術(shù)是一種用來制備多孔且空間互連的納米纖維的技術(shù)。在紡絲過程中，帶電聚合物溶液進(jìn)行噴射紡絲，在接收器上形成直徑為納米級的超細(xì)纖維[7-9]。制得的納米纖維具有孔隙率高、比表面積大、均一性好、能最大程度仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)等特點，被廣泛地應(yīng)用于組織工程、創(chuàng)傷敷料、藥物載體等生物制藥等領(lǐng)域[10-15]。挖掘傳統(tǒng)有效中藥作為原料，利用靜電紡絲技術(shù)制備成納米纖維，探索新型創(chuàng)傷修復(fù)材料，進(jìn)一步發(fā)揮中藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合和組織修復(fù)的作用，具有重要的意義。

本研究采用靜電紡絲法制備白芨/聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）復(fù)合納米靜電紡絲膜，通過檢測其微觀形貌、生物活性和生物相容性，探索傳統(tǒng)中藥白芨在外科生物醫(yī)用領(lǐng)域新應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

選用高壓靜電紡絲機（自制無針頭，實驗室自主設(shè)計），BSA124S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），TJ-3A型微量注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司），G20型離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司），DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司），LEICA SP8激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國），CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司），DZF-6020真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），BD LSRFortessa X-20流式細(xì)胞儀（美國BD公司），100目細(xì)篩白芨粉劑（上海虹橋中藥材有限公司），聚乙烯醇（中國Aladdin公司），戊二醛（中國Aladdin公司），37%優(yōu)級純鹽酸（中國Aladdin公司），甘氨酸和乙醇固化緩沖液（中國Sango生物技術(shù)公司），人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T（江西江藍(lán)純生物試劑有限公司），DMEM（美國Gibco公司）和10%胎牛血清（美國FBS，HyClone，Logan），Calcein-AM /PI（英國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 制備白芨和聚乙烯醇復(fù)合靜電紡絲膜：用PVA（15 wt%）溶液為基體，將PVA溶于50 ℃的去離子水中并攪拌2 h。將100目細(xì)篩白芨粉劑（5 wt%）在去離子水中稀釋，分別以1:2、1:3、1:4、1:5、直至1:10的BS:PVA體積比混合，以溶液紡絲性為判斷標(biāo)準(zhǔn)，探究BS:PVA最優(yōu)的配合比。將配好的不同BS:PVA混合比溶液加入溶液槽中，低速攪拌均勻，然后通過外加電場進(jìn)行紡絲，以出絲量為判斷標(biāo)準(zhǔn)，探究最優(yōu)的混合比例。然后在50 ℃條件下攪拌60 min，以保證均勻性。

搭建無針靜電紡絲體系，旋轉(zhuǎn)圓筒在溶液槽中旋轉(zhuǎn)，由于高分子的比表面張力，圓筒在旋轉(zhuǎn)過程中會在旋轉(zhuǎn)圓筒的表面加載薄層BS/PVA聚合物溶液，納米纖維以3 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，收集距離為20 cm，施加電壓為40 kV，環(huán)境條件控制在濕度43%和溫度25 ℃。

1.2.2 白芨和聚乙烯醇復(fù)合靜電紡絲膜形貌表征：將樣品接種在納米纖維皿上，在室溫下用2.5 wt%戊二醛固定過夜，然后用PBS洗滌，并用梯度等級濃度（50%～100% v/v）的乙醇脫水15 min。用掃描電子顯微鏡（SEM）對白芨和聚乙烯醇復(fù)合靜電紡絲膜的形貌、納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。利用Image J軟件對納米纖維的直徑和分布進(jìn)行分析。

1.2.3 細(xì)胞活性熒光染色和計數(shù)實驗：細(xì)胞培養(yǎng)前，靜電紡BS/PVA納米纖維必須交聯(lián)，因為所制得的納米纖維可以在水中立即溶解。交聯(lián)時，將纖維養(yǎng)護(hù)在含5 mL 50% GA、5 mL 37% HCl、40 mL乙醇的混合溶液中，室溫下浸泡12 h，然后用無菌水沖洗3次。所有BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜在使用前用5%的甘氨酸浸泡過夜解毒。

人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T置于37 ℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱中。并將其保存在Dulbecco改良DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和10%胎牛血清中培養(yǎng)并傳代。

用BS/PVA納米纖維包被蓋玻片，放入24孔板中，將人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T接種于BS/PVA納米纖維包被蓋玻片。用0.1 g/L多聚賴氨酸包被蓋玻片做對照組，分別放入24孔板內(nèi)，密度調(diào)整至5×108/L，孵育3 d分別將兩組蓋玻片取出。用PBS沖洗3次，加入終濃度為4 μmol/L的Calcein-AM和20 μmol/L的PI熒光染液，然后在37 ℃恒溫箱中孵育30 min，用PBS沖洗3次，甘油封片后置于Leica SP8顯微鏡觀察圖像：綠色為Calcein-AM標(biāo)記的為具有細(xì)胞活性的活細(xì)胞，紅色為PI標(biāo)記的為已破膜的死細(xì)胞。分別于第1、24、48小時觀察計數(shù)，隨機選取6個視野，計算活細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值。

1.2.4 流式檢測細(xì)胞周期實驗：人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T置于37 ℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱中。并將其保存在Dulbecco改良DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和10%胎牛血清中培養(yǎng)并傳代。

流式細(xì)胞術(shù)測量了BS/PVA納米纖維包覆基質(zhì)和非包覆表面下的細(xì)胞周期，通過流式細(xì)胞術(shù)測量不同基質(zhì)下的細(xì)胞周期。使用BD LSRFortessa X-20流式細(xì)胞儀，制備細(xì)胞懸液1×107/mL，PBS洗滌3次，棄去固定液。400目的篩網(wǎng)過濾1次，1000 r/min離心2 min，棄去PBS。然后用FITC和PI處理，4 ℃避光30 min。BD LSRFortessa X-20自動熒光系統(tǒng)下進(jìn)行細(xì)胞流式術(shù)。

2 結(jié)果

2.1 制備白芨和聚乙烯醇復(fù)合靜電紡絲膜的最佳參數(shù)

在本研究中我們采用旋轉(zhuǎn)圓筒無針靜電紡絲工藝，并將BS/PVA溶液用于納米纖維的制備。在此過程中，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對機器施加高電壓（40 kV）時，圓柱體產(chǎn)生的尖刺和泰勒錐由此形成。然后，細(xì)小的聚合物射流從泰勒錐的尖端噴射到納米纖維基體上。在紡絲10～15 min后，我們可以獲得BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜（圖1）。最佳參數(shù)為：BS/PVA 1:3，轉(zhuǎn)速3 r/min，采集距離20 cm，外加電壓為40 kV。環(huán)境條件控制在濕度43%和溫度25 ℃。

圖1 白芨和聚乙烯醇納米靜電紡絲纖維膜

2.2 白芨和聚乙烯醇復(fù)合納米靜電紡絲膜形貌表征

我們發(fā)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)圓筒無針靜電紡絲工藝產(chǎn)生均勻的納米纖維形成纖維膜。用掃描電子顯微鏡對BS/PVA納米靜電紡絲膜的形貌、納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，該納米纖維表面光滑、形貌均一，未見明顯串珠結(jié)構(gòu)（圖2）。為了確定納米纖維的直徑，我們使用Image J進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)BS/PVA納米纖維約為800 nm，它們均勻地分布在一個薄片上，形成一層薄膜。

圖2 掃描電鏡下白芨和聚乙烯醇復(fù)合納米靜電紡絲纖維膜形貌表征

2.3 細(xì)胞活性熒光染色和計數(shù)實驗結(jié)果

定性分析HEK293細(xì)胞在BS/PVA納米纖維膜包被蓋玻片和對照組蓋玻片上的活性和分布。在黑暗條件下，Leica DMi8熒光顯微鏡觀察，綠色為活細(xì)胞，紅色為死細(xì)胞（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BS/PVA納米纖維膜包被蓋玻片上HEK293細(xì)胞存活率提高至93%，而用對照組HEK293細(xì)胞存活率僅提高至90%（圖3B）。為了觀察更詳細(xì)的細(xì)胞形態(tài)，引入了SEM對細(xì)胞樣品進(jìn)行成像。在BS/PVA靜電紡絲納米纖維膜上培養(yǎng)的HEK293表現(xiàn)為扁平的細(xì)胞形態(tài)（圖4）。

2.4 流式檢測細(xì)胞周期實驗結(jié)果

結(jié)果顯示BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜基質(zhì)上HEK293細(xì)胞的細(xì)胞周期，與無BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜基質(zhì)HEK293的細(xì)胞周期基本相同（圖5）。

圖3 A：細(xì)胞活性熒光染色（×400）；B：細(xì)胞活性計數(shù)實驗結(jié)果（細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）。

圖4 HEK293細(xì)胞在BS/PVA靜電紡絲納米纖維上的掃描電鏡觀察（×2500）

圖5 流式檢測細(xì)胞周期實驗結(jié)果，藍(lán)色為BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜基質(zhì)上HEK293細(xì)胞的細(xì)胞周期，橙色為無BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜基質(zhì)HEK293細(xì)胞的細(xì)胞周期。

3 討論

如何加速創(chuàng)面愈合和組織修復(fù)一直是外科醫(yī)師面臨的問題，用靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維孔隙率高，比表面積大，均一性好，能最大程度仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)。藥物能以無定型狀態(tài)存在于納米纖維中，從而改善了難溶性狀況，主動參與傷口愈合過程[16]。靜電紡納米纖維敷料可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移，加速創(chuàng)傷修復(fù)，抑制疤痕，在該領(lǐng)域中有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景[17]。我們前期工作發(fā)現(xiàn)通過靜電紡絲技術(shù)制備白芨納米纖維，覆膜于生物補片，用于大鼠腹壁缺損模型修復(fù)，結(jié)果顯示電紡絲納米白芨覆膜生物補片組的組織重建速度要快于普通生物補片組[18]。作為創(chuàng)面愈合和組織修復(fù)的材料，需易于大規(guī)模制備，形貌優(yōu)良穩(wěn)定，無毒性且生物相容性好。本研究嘗試優(yōu)化工藝參數(shù)，將疏水性中藥白芨和PVA混合，以大規(guī)模制備BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜。通過研究其微觀形貌、生物活性和生物相容性，探索白芨在外科生物醫(yī)用領(lǐng)域新應(yīng)用的可行性。

靜電紡絲技術(shù)可分針式和無針式兩類，兩者設(shè)備的設(shè)計因不同的實驗室、工廠各不相同。在本研究中我們采用旋轉(zhuǎn)圓筒無針靜電紡絲工藝，并將BS/PVA溶液用于納米纖維的制備。PVA是FDA認(rèn)證的用于藥物傳遞和生物醫(yī)藥應(yīng)用的高分子材料，具有良好的生物相容性和可行性。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對機器施加高電壓（40 kV）時，圓柱體產(chǎn)生的尖刺和泰勒錐由此形成，細(xì)小的聚合物射流從泰勒錐的尖端噴射到納米纖維基體上，在紡絲10～15 min后，可以獲得BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜。最佳參數(shù)為：BS:PVA=1:3，轉(zhuǎn)速=3 r/min，采集距離=20 cm，外加電壓為40 kV，環(huán)境條件控制在濕度43%和溫度25 ℃，得到最終直徑為800 nm的纖維膜片。由于無針圓筒靜電紡絲技術(shù)能提供更高的生產(chǎn)率，采用上述優(yōu)化工藝參數(shù)，可以穩(wěn)定地制備大規(guī)模納米靜電紡絲纖維膜。

掃描電子顯微鏡觀察BS/PVA納米靜電紡絲纖維膜，發(fā)現(xiàn)無針圓筒靜電紡絲產(chǎn)生的BS/PVA納米靜電紡絲纖維，表面光滑、形貌均一，未見明顯串珠結(jié)構(gòu)，均勻地分布在一個薄片上，形成薄膜，使用Image J進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)BS/PVA納米纖維直徑約為800 nm。提示無針圓筒靜電紡絲技術(shù)不僅能提供更高的生產(chǎn)率，產(chǎn)生的BS/PVA納米靜電紡絲纖維形貌優(yōu)良穩(wěn)定。

通過細(xì)胞活性熒光染色和計數(shù)實驗結(jié)果顯示HEK293細(xì)胞生長良好，分布均勻，且經(jīng)活死細(xì)胞檢測試劑Calcein-AM和PI熒光染色，發(fā)現(xiàn)BS/PVA納米纖維膜可將細(xì)胞存活率提高至93%，而用非BS/PVA納米纖維膜對照組（多聚賴氨酸）的細(xì)胞存活率僅提高至90%，說明BS/PVA納米纖維膜細(xì)胞活力良好、無細(xì)胞毒性。為了觀察更詳細(xì)的細(xì)胞形態(tài)，我們引入了SEM對細(xì)胞樣品進(jìn)行成像，在BS/PVA靜電紡絲納米纖維膜上培養(yǎng)的HEK293表現(xiàn)為扁平的細(xì)胞形態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在表面附著良好，且它們是由具有絲狀偽足的界面納米纖維形成的。以上均表明BS/PVA納米纖維膜有助于HEK293細(xì)胞的生長和增殖。這可能是由于BS/PVA納米纖維膜為HEK293細(xì)胞提供了與體內(nèi)相似的微環(huán)境，更有利于HEK293細(xì)胞的增殖、粘附和生長，而且白芨本身具備提高細(xì)胞的增殖能力的緣故。

此外，為了了解培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞周期模式，我們采用流式細(xì)胞術(shù)測量了BS/PVA納米靜電紡絲包覆基質(zhì)和非包覆表面下的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示納米纖維基質(zhì)上的細(xì)胞周期與天然組織移植物上的細(xì)胞周期基本相同。因此，這些數(shù)據(jù)表明BS/PVA納米纖維具有良好的生物相容性。

總之，疏水性中藥白芨通過優(yōu)化工藝參數(shù)，和PVA混合，可以大規(guī)模制備成納米靜電紡絲膜。該膜可提高附著細(xì)胞活性，生物相容性好。此法拓寬了傳統(tǒng)中藥白芨在外科生物醫(yī)用領(lǐng)域的應(yīng)用，其促進(jìn)創(chuàng)面愈合、組織修復(fù)等功能，是今后可以研究的方向。