基于直接涂抹法的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定常見酵母樣真菌截?cái)嘀档拇_定及驗(yàn)證

李艷君，薛 珊，董 蓉，趙強(qiáng)元

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 檢驗(yàn)科，北京 100048

近年來，隨著腫瘤、艾滋病等免疫受損患者的增多，免疫抑制劑及廣譜抗生素的長(zhǎng)期使用，介入治療手段的開展，真菌感染發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，尤其是侵襲性真菌感染，是感染性疾病死亡的主要原因之一[1-3]。真菌感染病原的快速鑒定對(duì)于臨床搶先實(shí)施抗真菌治療，降低病死率至關(guān)重要。近年來，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS) 突 破傳統(tǒng)方法鑒定耗時(shí)長(zhǎng)、鑒定能力不足等弊端，在臨床得以廣泛應(yīng)用[4-6]。然而由于前處理方法不同，儀器推薦的甲酸萃取法的截?cái)嘀狄话悴贿m用于常規(guī)直接涂抹法的真菌鑒定，給鑒定結(jié)果的判斷帶來一定困擾，因此有必要在各自實(shí)驗(yàn)室條件下評(píng)價(jià)適宜的真菌鑒定截?cái)嘀怠１狙芯繉?duì)直接涂抹法進(jìn)行酵母樣真菌MALDI-TOF-MS 鑒定的截?cái)嘀颠M(jìn)行評(píng)價(jià)，詳述如下。

資料與方法

1 標(biāo)本來源 2018 年1 月- 2019 年6 月我中心臨床送檢真菌培養(yǎng)樣本中分離培養(yǎng)出的酵母樣真菌共計(jì)494 株。

2 儀器與試劑 德國(guó)Bruker 公司的Microflex 系列MALDI-TOF 質(zhì)譜儀及配套的標(biāo)準(zhǔn)品、基質(zhì)液；法國(guó)梅里埃沙保羅真菌培養(yǎng)基；上海一恒MJ-II 霉菌培養(yǎng)箱。

3 真菌分離培養(yǎng) 臨床送檢樣本以三區(qū)劃線方式接種于沙保羅培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，挑選乳酪樣純菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4 樣品制備 將純培養(yǎng)菌落用牙簽均勻涂抹于靶板上，加1μl 甲酸覆蓋，晾干后滴加1μl 基質(zhì)液，待其干燥后上機(jī)鑒定。

5 MALDI-TOF-MS 鑒定 打開Flexcontrol3.4 軟件，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，選擇377 nm 氮?dú)饧す猓€性陽(yáng)離子檢測(cè)模式，質(zhì)荷比采集范圍2 000 ～ 20 000 Da，激光強(qiáng)度30%，每個(gè)樣本擊打5 個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)激光轟擊100 次，記錄鑒定結(jié)果和分值。

6 真菌18SrDNA 測(cè)序鑒定 所有菌株DNA 通過酵母菌基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，擴(kuò)增引物序列為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；擴(kuò)增條件為95℃ 5 min，(95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min)×30 循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物上機(jī)測(cè)序，序列結(jié)果登錄NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，獲得菌種鑒定結(jié)果。以18SrDNA 測(cè)序鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)譜鑒定結(jié)果與其一致時(shí)定義為鑒定正確。

7 數(shù)據(jù)分析 以質(zhì)譜鑒定分值為輸入數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。繪制ROC 曲線，計(jì)算曲線下面積和約登指數(shù)，約登指數(shù)最大時(shí)對(duì)應(yīng)的數(shù)值即為最佳截?cái)嘀?。?yīng)用χ2檢驗(yàn)比較不同截?cái)嘀佃b定的正確率和錯(cuò)誤率。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 MALDI-TOF MS 鑒定結(jié)果分析 與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，494 株酵母樣真菌中，MALDI-TOF MS 鑒定正確27 種，463 株，正確率93.7%，鑒定分值1.301 ～ 2.235，見表1，鑒定錯(cuò)誤31 株，占比6.3%，鑒定分值1.11～1.810，見表2。

表1 463 株鑒定正確的酵母菌種類及鑒定分值Tab. 1 Classification and identification scores of 463 corrected identified yeasts

表2 31 株鑒定錯(cuò)誤的酵母菌種類及鑒定分值Tab. 2 Classification and values of 31 uncorrected identified yeasts

2 ROC 曲線分析結(jié)果 由上述資料知，鑒定正確的分值較高，錯(cuò)誤的相對(duì)較低，提示鑒定分值的水平分布，可能與鑒定正確程度(正確率)有關(guān)。故進(jìn)一步探討之。以鑒定正確的資料為陽(yáng)性樣本(n=463)，以鑒定錯(cuò)誤的資料為陰性樣本(n=31)，建立接收者工作特征曲線(receiver operation characteristic，ROC)診斷分析模型。并以質(zhì)譜鑒定分值為數(shù)據(jù)繪制ROC 曲線。結(jié)果：酵母樣真菌鑒定在不同臨界值時(shí)的敏感度、特異性及約登指數(shù)見表3。鑒定分值為1.6 時(shí)約登指數(shù)最大，為0.722，其對(duì)應(yīng)的敏感度為0.86，特異性為0.88，ROC 曲線下面積為0.929，見圖1，故1.6 為最適宜截?cái)嘀怠?/p>

3 不同截?cái)嘀佃b定結(jié)果的比較 經(jīng)實(shí)際測(cè)試，截?cái)嘀禐?.0 時(shí)，鑒定正確正確率為7.5%。截?cái)嘀禐?.6 時(shí)鑒定正確率77.7%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，鑒定正確率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.001，見表4。

圖 1 MALDI-TOF-MS鑒定酵母樣真菌的ROC曲線Fig. 1 ROC curve of yeast identification using MALDI-TOF-MS

表3 不同截?cái)嘀档拿舾卸群吞禺愋訲ab. 3 Sensitivities and specificities according to different cut-off values

表4 不同截?cái)嘀佃b定結(jié)果比較Tab. 4 Comparison of identification results with different cut-off values

討 論

近年來隨著抗生素、激素類藥物及免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，免疫功能受損患者不斷增加，真菌感染已成為臨床抗感染治療中較為棘手的問題[7]，不同真菌對(duì)抗真菌藥物的敏感度差異較大，因此在感染早期快速準(zhǔn)確地鑒定出病原真菌的種類已經(jīng)成為臨床診斷和治療的關(guān)鍵[8-9]。

MALDI-TOF MS 是一種新型軟電離生物質(zhì)譜儀，主要由兩部分組成，即基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)。其原理是菌體蛋白在基質(zhì)液作用下帶電荷，在激光光源轟擊下解離，帶電荷的蛋白分子經(jīng)電場(chǎng)加速，在真空飛行管中飛行，進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)譜分析器進(jìn)行質(zhì)量分析，檢測(cè)器檢測(cè)到不同質(zhì)荷比(m/z)的離子，并以離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，以離子峰為縱坐標(biāo)形成特異性的蛋白質(zhì)組指紋圖譜，進(jìn)而與數(shù)據(jù)庫(kù)中圖譜進(jìn)行對(duì)比，得到鑒定結(jié)果并最終確定細(xì)菌種類。MALDI-TOF MS 具有快速、準(zhǔn)確、高通量、操作簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，近年來越來越廣泛用于臨床各種感染病原的鑒定[10-12]，尤其在酵母樣真菌鑒定中優(yōu)于傳統(tǒng)生化反應(yīng)的方法，大大提高了真菌的鑒定能力[13-16]。

對(duì)于真菌的鑒定，目前采用甲酸萃取法進(jìn)行標(biāo)本的前處理，通過甲酸和乙腈溶液的萃取，使菌體蛋白釋放，從而獲得高質(zhì)量的蛋白譜峰。對(duì)于布魯克Microflex 系列質(zhì)譜儀，真菌鑒定的截?cái)嘀翟O(shè)定在2.0 以上。然而在常規(guī)工作中，甲酸萃取法比較耗時(shí)，單個(gè)標(biāo)本大約用時(shí)10 min 左右，如果日常真菌鑒定樣本量較大，甲酸萃取法將不利于快速檢測(cè)，并且由于酵母樣真菌細(xì)胞壁較厚，即使采用甲酸萃取后檢測(cè)，鑒定分值也很難達(dá)到2.0 以上，致使種水平的鑒定率較低。相對(duì)于甲酸萃取法，直接涂抹法更加簡(jiǎn)便省時(shí)，即將純培養(yǎng)菌落直接涂抹于靶板上，加1μl 甲酸覆蓋后再加1μl 基質(zhì)液即可上機(jī)檢測(cè)。國(guó)外有研究報(bào)道多中心聯(lián)合進(jìn)行MALDI-TOF MS 真菌鑒定流程的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)與甲酸萃取法相比，直接涂抹法并未明顯降低蛋白譜峰的質(zhì)量，而且適當(dāng)降低截?cái)嘀祵?duì)鑒定準(zhǔn)確性的影響不大，且可以提高種水平的鑒定率[17-19]。

本研究對(duì)27 個(gè)菌種，494 株臨床常見酵母菌，采用直接涂抹法制備樣本，并對(duì)該方法的截?cái)嘀颠M(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，直接涂抹法進(jìn)行酵母樣真菌的鑒定具有較高的正確率，可達(dá)93.7%。對(duì)于31 株鑒定錯(cuò)誤的菌株，除前處理方法的影響外，還可能由于某些菌種的譜圖未存在于商品化的數(shù)據(jù)庫(kù)中，如庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母菌和奇異酵母菌，盡管鑒定分值不低，但卻未得到正確的鑒定結(jié)果，對(duì)于這一類菌株的鑒定，可通過在開放的數(shù)據(jù)庫(kù)中增加更多菌種的譜圖來完善。

以質(zhì)譜鑒定分值為數(shù)據(jù)繪制ROC 曲線，本研究確定的直接涂抹法進(jìn)行酵母菌鑒定的截?cái)嘀禐?.6。按照原采用的甲酸萃取法截?cái)嘀?，鑒定分值大于2.0 為可信的種水平株鑒定結(jié)果，494 株菌中只有37 株的鑒定結(jié)果可信，采用1.6 為閾值，384株菌獲得可信的鑒定結(jié)果，所以與原截?cái)嘀迪啾?，大大提高了菌種的鑒定正確率，經(jīng)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，通過對(duì)494 株臨床常見酵母菌鑒定數(shù)據(jù)的分析，采用直接涂抹法進(jìn)行標(biāo)本前處理具有較高的正確率，截?cái)嘀?.6 是較為適宜的鑒定閾值，可提高酵母樣真菌的鑒定率。由于不同國(guó)家、地域真菌感染類型和菌種分布不同，確定的截?cái)嘀悼赡軙?huì)有所差異，實(shí)驗(yàn)室可收集各自醫(yī)院的臨床菌株進(jìn)行評(píng)估，選取適宜的截?cái)嘀颠M(jìn)行基于MALDI-TOF MS 的酵母菌的鑒定。