昆布多糖對大鼠心肌缺血/再灌注模型葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶12蛋白表達含量的影響

黨淼，李鐵成

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，遼寧 錦州 121000)

由于我國心血管疾病城鄉(xiāng)發(fā)病率越來越高和逐漸低齡化，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療等冠狀動脈再通恢復(fù)冠狀動脈血流的技術(shù)愈趨成熟，心肌缺血再灌注損傷缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)作為影響心血管疾病預(yù)后的重要因素，得到了廣泛關(guān)注[1]。近年研究表明[2]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了MI/RI的發(fā)生發(fā)展，并與氧自由基生成過多、鈣超載等機制相互作用。在病理因素如缺血、缺氧、炎癥的作用下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的合成運輸障礙，腔內(nèi)堆積大量的未折疊或錯誤折疊的蛋白，激活葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(glucose regulated protein-78，GRP-78)，啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。當(dāng)損傷持續(xù)存在時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動凋亡信號通路GRP-78/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶12(cysteine-dependent aspartate-specific protrases 12，Caspase 12)等途徑誘導(dǎo)細胞凋亡[3]。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在MI/RI的病理生理環(huán)節(jié)中具有重要作用[4]。

昆布多糖(Laminarin，Lam)是存在于昆布中的大分子多糖物質(zhì)。國內(nèi)外研究表明，Lam具有抑菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、降血糖等廣泛的生物學(xué)活性[5]，具有重要的研究與開發(fā)價值。本研究建立大鼠MI/RI模型，觀察大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)、髓過氧化物(myeloperoxidase，MPO)的含量，以及心肌組織中GRP-78、Caspase 12、B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的蛋白表達情況，根據(jù)心肌組織損傷程度進一步探討Lam對大鼠心肌是否有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lam(北京索萊寶生物科技有限公司，中國北京)；CK-MB試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國上海)；MPO試劑盒(南京建成生物工程中心，中國南京)；兔抗鼠GRP-78、Bcl-2多克隆抗體(美國Santa cruz公司，美國)；內(nèi)參兔抗鼠β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ig G(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國北京)；蛋白提取裂解液、聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置試劑盒、BCA(bicinchonininc acid)蛋白濃度檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光試劑盒(海門市碧云天生物技術(shù)研究所，中國海門)；辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗小鼠Ig G(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，中國上海)；其它由錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗科研中心的實驗室提供。

1.2 實驗動物與分組

清潔健康的雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(200±20)g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動物實驗科研中心提供，隨機數(shù)表法分為4組，每組8只。(1)假手術(shù)組(sham組)：普通飼料及飲用水喂養(yǎng)2周，開胸后冠狀動脈穿線不結(jié)扎；(2)MI/RI組：開胸后冠狀動脈穿線，結(jié)扎45 min，再灌注180 min；(3)低劑量組：術(shù)前Lam 50 mg/kg灌胃2周，開胸后穿線，結(jié)扎45 min，再灌注180 min；(4)高劑量組：術(shù)前Lam 100 mg/kg灌胃2周，開胸后穿線，結(jié)扎45 min，再灌注180 min。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠MI/RI模型 術(shù)前12 h禁食不禁水。20%烏拉坦(6 ml/kg)腹腔注射進行麻醉。仰臥位并將四肢固定于實驗臺上，針形電極插入大鼠四肢皮下，連接心電圖機，氣管插管接人工呼吸機(頻率55次/min，潮氣量15 ml/kg)。沿胸骨左側(cè)旁行切口，剪開皮膚。用止血鉗鈍性分離肌肉，充分暴露第2、3根肋骨，剪斷肋骨，充分暴露心包，小心剪開心包膜，充分暴露心臟。除sham組穿線不結(jié)扎外，各組均在肺動脈圓錐和左心耳之間左前降支冠狀動脈處穿一縫合線，穿過一個有活口的硅膠管，系緊結(jié)扎線，45 min后剪掉帶有活口的硅膠管的結(jié)扎線，使心肌血流恢復(fù)，隨后保持180 min再灌注。結(jié)扎冠狀動脈后見心電圖ST段立即抬高；再灌注時抬高的ST段回落50%以上為造模成功的標(biāo)志。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗和比色法測定CK-MB和MPO (1)CK-MB：取離心后的血漿上清液，加樣，用封板膜封板后置37℃溫育60 min，洗滌5次，拍干，加入顯色劑，37℃避光顯色15 min，加終止液終止反應(yīng)，測定吸光度(Anm)。(2)MPO：稱取心尖組織100 mg制作成樣本，通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，比色法測定產(chǎn)物的生成量，推算MPO含量。

1.3.3 Western blotting檢測GRP-78、Caspase 12和Bcl-2 取40 mg大鼠心臟組織加入裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinglident fluoride, PVDF)膜，5%脫脂奶的TBST液封閉1 h，洗滌3次，兔抗鼠GRP-78多克隆抗體及兔抗鼠β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)孵育，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ig G(1∶5 000稀釋)，化學(xué)發(fā)光法進行成像。Image Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白和β-actin比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達量。Caspase 12、Bcl-2抗體方法同上。

1.3.4 心肌組織的病理形態(tài)學(xué)改變 將大鼠心室肌組織放置于4%多聚甲醛溶液中固定。乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，進行HE(hematoxylin-eosin)染色，光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)的變化。

1.3.5 心肌梗死面積測定 實驗結(jié)束前，經(jīng)冠狀動脈逆行灌注1% Evans Blue 2 ml，將非缺血區(qū)藍染，未被染色區(qū)域為危險區(qū)(area at risk，AAR)。迅速取出心臟，置于生理鹽水中，分離左心室。-20℃冰箱冷凍1 h后，沿心尖至基底部剪成5個2 mm的切片，放入1%氯化三苯基四氮唑紅(triphenyltetrazolium chloride，TTC)的磷酸緩沖液中，37℃水浴30 min。染色后梗死區(qū)呈灰白色，缺血區(qū)呈磚紅色。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件測量心肌缺血范圍和心肌梗死范圍。心肌缺血范圍=AAR/左室面積(left ventricle，LV)×100%；心肌梗死范圍=梗死區(qū)面積(infarction size，IS)/AAR×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組CK-MB、MPO的含量比較

與sham組比較，MI/RI組CK-MB、MPO表達水平顯著升高(P<0.01)，與MI/RI組比較，低劑量組和高劑量組CK-MB、MPO的表達水平均顯著降低(P<0.01)，與低劑量組比較，高劑量組降低更顯著(P<0.01；表1)。

表1 各組CK-MB、MPO表達量的比較

2.2 各組GRP-78、Caspase 12、Bcl-2蛋白表達比較

與sham組比較，MI/RI組GRP-78、Caspase 12水平顯著升高(P<0.01)，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.01)。與MI/RI組比較，低劑量組和高劑量組GRP-78、Caspase 12的表達水平顯著降低(P<0.01)，Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.01)，與低劑量組比較，高劑量組各蛋白改善水平更為顯著(P<0.01；圖1，表2)。

圖1 各組GRP-78、Caspase 12、Bcl-2表達情況比較

表2 各組GRP-78、Caspase 12、Bcl-2蛋白的表達量

2.3 各組心肌組織的病理形態(tài)學(xué)改變

光鏡下sham組心肌細胞肌纖維排列整齊緊密，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細胞核清晰可見；MI/RI組多數(shù)細胞腫脹，肌纖維斷裂、缺損，細胞間質(zhì)大量水腫并伴有大面積出血；低劑量組細胞出現(xiàn)輕微腫脹，胞內(nèi)空泡增多，伴少量出血，但細胞核清晰可見，細胞膜完整；高劑量組肌纖維排列基本完整，細胞間質(zhì)少量水腫腫脹，未見血管擴張，細胞結(jié)構(gòu)相對完整(圖2)。

圖2 光鏡下各組心肌病理學(xué)變化

2.4 各組心肌梗死面積比較

sham組未見明顯缺血區(qū)，其余3組間心肌缺血范圍差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與MI/RI組比較，低劑量和高劑量組的心肌梗死范圍顯著減少(P<0.01)，與低劑量組比較，高劑量組心肌梗死范圍減少更顯著(P<0.05；表3，圖3)。

圖3 各組心肌梗死面積的比較

表3 各組心肌梗死面積的比較

3 討 論

GRP-78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性啟動蛋白[6]。GRP-78在行使“代償性”內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護作用的同時，其表達量會隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時間延長而減少。這可能是由于持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅使GRP-78表達增加，也激活了CHOP、JNK和Caspase 12等多個凋亡通路信號[7]。Caspase 12的激活是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激唯一不依賴于其他通路獨立誘導(dǎo)細胞凋亡的通路[8,9]。有實驗表明，在輸尿管梗阻早期，Lam可能通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP-78、GRP-94蛋白表達，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號傳導(dǎo)通路，從而減輕早期腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展[10]。昆布多糖硫酸酯不僅能顯著降低受損心肌細胞內(nèi)氧自由基含量[11]，還能有效地清除氧自由基，減輕氧化損傷和治療肺纖維化[12]。GRP-78的表達量反映MI/RI時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的程度，Caspase 12、Bcl-2的表達量反映心肌細胞凋亡的程度。本研究結(jié)果表明，與sham組比較，MI/RI組GRP-78、Caspase 12的表達增加，凋亡基因Bcl-2的表達減少，表明在MI/RI期間可能發(fā)生了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的Caspase 12相關(guān)凋亡途徑，并誘導(dǎo)了細胞凋亡；與MI/RI組比較，Lam低、高劑量組GRP-78、Caspase 12蛋白的表達減少，Bcl-2表達增加，可能與Lam預(yù)處理抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡、產(chǎn)生心肌保護作用有關(guān)。

HE染色和心肌梗死面積雙染的觀察能直接反映心肌組織損傷的程度。本實驗結(jié)果表明，Lam處理組明顯減輕心肌組織的損傷，高劑量組更顯著，提示Lam預(yù)處理具有心肌保護作用，可能機制為Lam抑制GRP-78的過度表達，抑制了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細胞凋亡途徑的激活，下調(diào)了Caspase 12凋亡通路，增強了Bcl-2的表達，從而減輕了心肌細胞凋亡。

昆布在食物及藥材中廣泛存在，但Lam提取、分離、提純等過程尤為復(fù)雜且成本較高，目前如何提取Lam仍是食品生物工程等學(xué)科的研究熱點。本實驗表明，Lam可通過抑制由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細胞凋亡途徑，對心肌產(chǎn)生保護作用。但由于MI/RI的發(fā)病機制由多個通路共同作用，相互聯(lián)系，具體機制目前還無明確定論。本實驗僅從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激角度出發(fā)，探討Lam是否與細胞凋亡有關(guān)，因而相對具有局限性，具體機制還有待進一步實驗驗證討論。