一種滴滴涕膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條的研制

□ 萬(wàn)宇平 何方洋 賈芳芳 崔娜 崔海峰 北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心

□ 鄭百芹（通信作者） 唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心

引言

滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，簡(jiǎn)稱“DDT”）是一種高毒有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，其應(yīng)用廣泛，因?qū)οx(chóng)有觸殺、胃毒等作用而被用于防治蚊蠅和臭蟲(chóng)[1-3]。由于該藥物化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，容易富集污染環(huán)境，并可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體而危害健康。因此，早在2009年，我國(guó)就已全面禁止了滴滴涕的生產(chǎn)、使用和進(jìn)出口。但時(shí)至今日，仍有部分養(yǎng)殖戶使用滴滴涕作為殺蟲(chóng)劑，故對(duì)該農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)具有必要性[4-6]。

目前，檢測(cè)滴滴涕的方法大多為儀器方法[7-14]，但此類(lèi)方法成本較高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜，不符合基層實(shí)驗(yàn)室高效、便捷的檢測(cè)要求。因此，本研究制備出一種滴滴涕的單克隆抗體，將其應(yīng)用于膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條，可實(shí)現(xiàn)高效、便捷的檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

滴滴涕、五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），購(gòu)自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；檸檬酸三鈉、碳酸鉀，購(gòu)自北京百欣試劑公司；樣本提取劑、樣本復(fù)溶液、膠體金分析儀，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供；渦旋儀、均質(zhì)器，購(gòu)自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司[15-16]。

圖1 滴滴涕半抗原合成

1.2 方法

1.2.1 滴滴涕半抗原的制備

取1.7g鄰氯苯乙酸，加5mL氯苯，再加入1.8g水合氯醛，加熱至完全溶解后，加入三氯化鋁5.38g，室溫?cái)嚢?h，停止反應(yīng)，加水80mL和乙酸乙酯120mL，萃取分離，分去水相，有機(jī)相無(wú)水硫酸鈉干燥蒸干，得到黃色油狀物，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯（v/v，1/1）洗脫分離，得到乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物1.8g，收率43.9%。

1.2.2 免疫原的制備—滴滴涕半抗原與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物合成

取乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物15mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC13.7mg和NHS10.9mg，充分混勻后，反應(yīng)4h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白（BSA）50mg，加0.05M PB溶解，得到B液。將A液滴加到B液中，4℃反應(yīng)24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到滴滴涕-BSA偶聯(lián)物，即免疫原，分裝后于-20℃保存。

圖2 滴滴涕膠體金試紙條結(jié)果判定示意圖

1.2.3 免疫原的制備—滴滴涕半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)物合成

取乙酸滴滴涕半抗原產(chǎn)物9mg，加DMF1mL，溶解澄清，加EDC7.6mg和NHS6.8mg，充分混勻后反應(yīng)4h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白（OVA）50mg，加 0.05M PB溶解，得到 B液。將A液滴加到B液中，4℃反應(yīng)24h后0.02M PBS透析純化3天，每天換液3次，得到滴滴涕-OVA偶聯(lián)物，即免疫原，分裝后于-20℃保存。

1.2.4 將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上

將滴滴涕單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物加入到微孔板中，冷凍干燥，得到滴滴涕單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干的微孔試劑[15-16]。

1.2.5 檢測(cè)方法

向微孔中加入100μL待檢樣本溶液，混勻，室溫下培育3min。吸取70μL溶液滴至試紙條上，反應(yīng)10min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果或通過(guò)膠體金分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果[15-16]。

1.2.6 樣本檢測(cè)限

在空白蔬菜、水果、飼料、牛奶樣本中分別添加滴滴涕標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L，按照“1.2.5”所述方法用3批試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限[15-16]。

1.2.7 試紙條的特異性

分別配制500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物，用膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定3次，判斷試紙條的特異性[15-16]。

1.2.8 準(zhǔn)確性

農(nóng)業(yè)部文件要求：以假陽(yáng)性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性[15-16]。取經(jīng)過(guò)儀器確證的50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質(zhì)量濃度小于5μg/kg）與50份陽(yáng)性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質(zhì)量濃度大于5μg/kg），用膠體金免疫快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)滴滴涕的殘留量，計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率[15-16]?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定：試紙條假陽(yáng)性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零[15-16]。

表1 滴滴涕快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限

表2 特異性測(cè)定

1.2.9 試紙條的穩(wěn)定性

將試紙條保存于2～8℃環(huán)境中，每隔1個(gè)月檢測(cè)試紙條的準(zhǔn)確性，連續(xù)測(cè)定15個(gè)月[15-16]。具體方法為：分別檢測(cè)經(jīng)過(guò)儀器確證的20份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質(zhì)量濃度小于5μg/kg）與20份陽(yáng)性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品（質(zhì)量濃度大于5μg/kg），重復(fù)測(cè)定2次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本檢測(cè)限

配置滴滴涕濃度分別為0、4、4.5、5、5.5、6μg/L的蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，按照“1.2.5”步驟進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)限[15-16]。結(jié)果顯示，該試紙條的檢測(cè)限為5μg/kg，見(jiàn)表1。

2.2 特異性

用試紙條檢測(cè)500μg/L的五氯硝基苯、百菌清和溴氰菊酯等藥物，結(jié)果均呈陰性（見(jiàn)表2），表明該試紙條特異性較好[15-16]。

2.3 準(zhǔn)確性

用試紙條檢測(cè)50份陰性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明假陽(yáng)性率低于5%；用試紙條檢測(cè)50份陽(yáng)性蔬菜、水果、飼料、牛奶樣品，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性（見(jiàn)表3），說(shuō)明該試紙條假陰性率為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求[15-16]。

表3 準(zhǔn)確性測(cè)定

2.4 穩(wěn)定性

試紙條保存12個(gè)月內(nèi)，其假陽(yáng)性率和假陰性率的檢測(cè)結(jié)果均符合要求；之后試紙條會(huì)出現(xiàn)少量失效、假陰性等現(xiàn)象[15-16]（見(jiàn)表4）。

3 討論

目前，有關(guān)檢測(cè)滴滴涕的文獻(xiàn)較為有限，本研究通過(guò)制備滴滴涕半抗原，讓其與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》要求，對(duì)試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等性能測(cè)試，均符合要求。此外，該試紙條的檢測(cè)時(shí)間僅為15min，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中儀器方法用時(shí)更短，操作更簡(jiǎn)便。