Cyclin D1與P27在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達及相關性

王一娜 童亞非

(東南大學附屬鹽城市第三人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)的首位[1]。宮頸癌有鱗狀細胞癌和腺癌兩種病理類型，其中鱗癌占絕大多數(shù)。目前研究認為人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染導致了一系列的癌基因被激活，并且導致細胞增殖和細胞凋亡紊亂，進而導致了宮頸癌的發(fā)生[2]。目前的研究[3]表明，Cyclin D1和P27在多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)表達明顯異常，或者有基因多態(tài)性的異常，但是在宮頸鱗癌中的二者的表達情況即相關性目前報道較少。本次研究通過免疫組織化學染色的手段研究Cyclin D1與P27蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達情況及其相關性，并且探討二者在宮頸鱗癌的發(fā)病機制中的作用。

1 資料和方法

1.1病例資料

收集自2008年1月至2011年12月4年間在我院婦產(chǎn)科就診并且進行活檢或者手術治療的宮頸組織172例，其中宮頸鱗癌102例，宮頸組織正常70例。宮頸鱗癌患者按照年齡進行分類，其中年齡<45歲者46例，≥45歲者56例；按照FIGO臨床分期標準對宮頸癌患者進行分期，Ⅰ期22例，Ⅱ期38例，III期42例；病理診斷為高分化鱗癌14例，中分化鱗癌50例，低分化鱗癌38例；術后病理診斷確認有淋巴結轉移34例，無淋巴結轉移68例，宮頸癌患者在進行手術之前均沒有經(jīng)過放療和化療等治療措施。采集病理標本均采用4%多聚甲醛進行固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為5 μm。

1.2實驗方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復5 min，3%過氧化氫孵育10 min去除內源性過氧化物酶，用5%正常兔血清封閉20 min后加羊抗人Cyclin D1一抗( 1∶100, 美國Sigma公司) ，羊抗人P27一抗(1∶200, 美國Sigma公司)，室溫過夜，PBST清洗，加辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG二抗( 1∶100，美國Santa Cruz公司)室溫孵育40 min；PBST清洗，加Elite-AP(英國Vector公司)孵育15 min，PBST清洗，DAB底物液(英國Vector公司)顯色20 min，蘇木素復染30 min，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，待干燥后光鏡下觀察攝片。

1.3染色結果判斷

染色結果顯示Cyclin D1和P27均定位于胞核中，以細胞核出現(xiàn)棕黃色染色作為陽性。在高倍鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，根據(jù)陽性細胞在全部組織細胞中所占比例判定實驗結果，陽性細胞數(shù)占全部組織細胞數(shù)比例<10%判斷為(-)，陽性細胞數(shù)占全部組織細胞數(shù)比例為10%～49%之間判斷為(+)，陽性細胞數(shù)占全部組織細胞比例陽性細胞數(shù)≥50%判斷為(++)，以(+)及以上作為陽性。

1.4統(tǒng)計學方法

所有的數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，各組樣本之間的比較采用χ2檢驗進行統(tǒng)計分析，Cyclin D1和P27之間的相關關系采用Spearman等級相關檢驗進行統(tǒng)計分析，以P≤0.05作為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1Cyclin D1和P27在不同組織中的陽性表達情況

Cyclin D1和P27在宮頸正常組織和宮頸鱗癌組織中的表達情況見表1。Cyclin D1在宮頸鱗癌中的陽性表達率明顯高于宮頸正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=50.12，P<0.05)。P27在宮頸正常組織中陽性表達率高于宮頸鱗癌組織，并且差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=71.70，P<0.05)。

表1 Cyclin D1和P27在不同宮頸組織中陽性表達情況

2.2Cyclin D1和P27在宮頸鱗癌組織中的表達以及與臨床病理指標的關系

Cyclin D1和P27在宮頸鱗癌陽性表達情況與年齡、FIGO臨床分期、病理分級和淋巴結轉移等臨床病例指標的關系見表2。

表2 Cyclin D1和P27在宮頸鱗癌組織中的表達以及與臨床病理指標的關系

2.3Cyclin D1和P27在宮頸鱗癌組織表達的相關性

使用Spearman等級相關檢驗分析二者之間的相關關系，結果為r=-0.46，P<0.05，提示Cyclin D1和P27在宮頸鱗癌組織表達存在負相關，見表3。

表3 Cyclin D1和P27在宮頸鱗癌組織表達的相關性

3 討 論

目前的研究已經(jīng)證實，宮頸癌的發(fā)生主要是感染HPV后，引發(fā)的局部宮頸組織的細胞增殖和凋亡之間的平衡被打破有密切關系。本研究通過免疫組化的方法來研究Cyclin D1和P27在宮頸鱗癌組織中的表達情況，結果顯示Cyclin D1在宮頸正常組織中的陽性表達率明顯的低于宮頸鱗癌組織，而P27在上述兩種組織中的陽性表達率正好相反，并且兩者之間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；通過分析Cyclin D1和P27在宮頸鱗癌陽性表達情況與年齡、FIGO臨床分期、病理分級和淋巴結轉移等臨床病理指標的關系，結果發(fā)現(xiàn)Cyclin D1在宮頸鱗癌中陽性表達率和年齡無關，但是在臨床分期晚、低分化和有淋巴轉移的患者中的陽性表達率明顯的高于臨床分期早、高分化沒有淋巴轉移的患者，并且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Cyclin D1 是細胞周期相關蛋白家族成員之一，其主要的功能是精確調控細胞周期，維持細胞正常生長發(fā)育平衡[4]。CyclinD1在G1 期與CDK4/CDK6 結合，并且使CDK4/CDK6活化，CDK4/CDK6能夠使得Rb磷酸化，磷酸化的pRb 活化E2F促進DNA合成，促使細胞由G1 期進入S 期[5-6]。 研究還表明，Cyclin D1 蛋白過表達可能導致細胞持續(xù)性增殖，最終形成腫瘤[7]。學者Li S[8]通過研究卵巢癌組織中的Cyclin D1的蛋白表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1在臨床分期較晚、分化程度較低的患者中的陽性表達率明顯增高，和我們的研究結果基本一致。

目前的研究結果，野生型P27 基因是一種抑癌基因。在正常細胞周期中， P27 的功能是抑制CDK4 發(fā)生磷酸化，從而抑制CyclinD1/CDK4復合物的活性，阻止細胞進入S 期[9-10]。我們的研究表明，P27在正常宮頸組織中的陽性表達率明顯高于宮頸鱗癌組織，并且在臨床分期晚、低分化和有淋巴轉移的患者中的陽性表達率明顯低于臨床分期早、高分化和沒有淋巴轉移的患者，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?，F(xiàn)有的研究[11]表明，P27表達水平下降或者P27基因發(fā)生突變，即由野生型P27變?yōu)橥蛔冃蚉27，都能夠導致對CyclinD1/CDK4復合物抑制減少，進而導致細胞周期過快運行，細胞增殖明顯增加，導致腫瘤的發(fā)生。 我們的研究結果和Huang LW等人[12]的研究結果基本一致。

本研究還顯示CyclinD1與P27在宮頸鱗癌中的表達呈負相關，提示P27可能通過影響CyclinD1的表達水平來調控細胞的凋亡，其主要的作用機制在于P27能夠通過直接下調CyclinD1/CDK4復合物的活性，推遲細胞從G1期進入S期。而P27表達水平下調則會減少CyclinD1/CDK4復合物的抑制作用，從而刺激細胞增殖，導致腫瘤的發(fā)生[13]。

我們的研究結果表明，CyclinD1在宮頸鱗癌的組織中高表達，并且其表達水平和臨床分期、病理分級以及淋巴結轉移相關；P27在宮頸鱗癌的組織中低表達，并且其表達水平和臨床分期、病理分級以及淋巴結轉移相關；CyclinD1和P27在宮頸鱗癌的組織負相關，提示CyclinD1和P27在宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起到了協(xié)同作用。

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