頭穴圍刺對缺血再灌注大鼠腦組織血管生成素-2和血管內(nèi)皮細胞生長因子表達的影響

師帥 欒凱迪 李虹霖 王玉玨 夏昆鵬 張金朋 馬祺昊 孫琦月 佟曉薇 韓盛旺

摘要 目的：觀察頭穴圍刺對缺血再灌注大鼠血管生成素-2（Ang2）和血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）表達的影響。方法：選取30只健康雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組和圍刺組，參照Zea-Longa報道的線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，圍刺組給予頭穴圍刺治療，3組分別于21 d取大鼠腦組織，采用HE染色觀察大鼠腦組織缺血結(jié)構(gòu)的變化;免疫組織化學觀察大鼠腦缺血陽性細胞表達情況;采用Western檢測Ang-2、VEGF蛋白表達水平。結(jié)果：針刺21 d后mNSS評分圍刺評分優(yōu)于模型組;與模型組比較，大鼠腦組織病理細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;針刺21 d后與模型組比較，大鼠腦組織缺血區(qū)域Ang-2、VEGF陽性表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;針刺21 d后與模型組比較，大鼠腦組織Ang-2、VEGF蛋白增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：頭穴圍刺可上調(diào)大鼠缺血再灌注區(qū)腦組織Ang-2、VEGF蛋白的表達，促進梗死區(qū)血管新生，幫助腦缺血再灌注損傷后的腦神經(jīng)修復，降低神經(jīng)功能缺損程度。

關鍵詞 頭穴圍刺;腦缺血再灌注;神經(jīng)功能缺損;促血管生成素-2;血管內(nèi)皮生長因子;腦神經(jīng)修復;血管新生

Effects of Scalp Acupoint Encircling Needling on the Expression of Ang-2 and VEGF in Brain Tissue of Rats with Ischemia-Reperfusion Injury

SHI Shuai1，2，LUAN Kaidi1，LI Honglin1，2，WANG Yujue1，2，XIA Kunpeng1，2，ZHANG Jinpeng1，2，Ma Qihao1，SUN Qiyue 1，TONG Xiaowei1，HAN Shengwang1，2

（1 The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University Of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China; 2 Heilongjiang University Of Chinese Medicine，Harbin 150000，China）

Abstract Objective：To observe the effects of scalp acupoint encircling needling on the expression of Ang-2 and VEGF in rats with ischemia-reperfusion injury.Methods：A total of 30 healthy male Wistar rats were randomly divided into a sham operation group，a model group and an encircling needling group，with 10 rats in each group.Rat cerebral ischemia-reperfusion model was prepared by thread embolization method reported by Zea-Longa.The encircling needling group was given scalp point encircling needling.The brain tissues of each group were taken from 21 days in 3 groups，and the changes of cerebral ischemic structure were observed by HE staining.Immunohistochemistry was used to observe the expression of positive cells in cerebral ischemia in rats，and Western Blot was used to detect the expression of Ang-2 and VEGF.Results：1）21 days later，the mNSS score and encircling needling were better than the model group.2）HE staining：Compared with the model group，the number of pathological cells in rat brain tissue decreased（P<0.05）.3）After 21 days of acupuncture，compared with the model group，the positive expression of Ang-2 and vascular endothelial growth factor in the ischemic area of rat brain tissue was significantly increased after immunohistochemical treatment（P<0.01）.4）Compared with the model group，the number of Ang-2 and vascular endothelial growth factor protein in the brain tissue of rats increased 21 days after acupuncture（P<0.01）.Conclusion：Scalp acupoint encircling needling can up-regulate the expression of Ang-2 and VEGF protein in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury，promote angiogenesis in infarcted area，help the repair of brain nerve after cerebral ischemia-reperfusion injury，and reduce the degree of neurological deficit.

Western檢測：大鼠斷頭取腦，將組織勻漿裂解，離心去沉淀，取上層清液。按照BCA試劑盒要求測量蛋白質(zhì)濃度，取等濃度等體積上樣變性蛋白，SDS-PAGE（10%）電泳2 h以后，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，一抗孵育過夜，VEGF（1∶1 000稀釋），Ang-2（1∶500），溫度保持4 ℃，TBST清洗膜5次×5 min，加入二抗（1∶8 000稀釋）室溫孵育2 h，TBST清洗5次×5 min，用ECL顯色，于數(shù)字成像系統(tǒng)下顯影，采用Image J檢測條帶密度。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，在對比實驗中涉及到2個數(shù)據(jù)集之間的數(shù)據(jù)，使用2個獨立樣本t檢驗的，方差不齊時采用近似t檢驗，陽性率之間的比較采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能障礙評分比較

針刺干預21 d后，與模型組比較，針刺組神經(jīng)功能卻訊評分明顯變小，其差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 HE染色結(jié)果

假手術組：大鼠大腦神經(jīng)細胞排列趨勢緊密，神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，無組織水腫現(xiàn)象，散見少量的凋亡小體和炎性細胞，血管無充血。模型組：大鼠大腦神經(jīng)細胞排列趨勢稀疏且紊亂，神經(jīng)元形態(tài)不甚規(guī)則，細胞數(shù)量顯著增加，可見大量炎性細胞和凋亡小體，毛細血管腫脹。針刺組：大鼠大腦病理改變較模型組有明顯好轉(zhuǎn)。大鼠大腦神經(jīng)細胞排布更加規(guī)則、分布趨勢相對緊密，神經(jīng)元細胞核固縮數(shù)目及炎性細胞數(shù)目顯著增加，毛細血管腫脹情況也有所改善。見圖1。

2.3 各組免疫組織化學結(jié)果比較

與假手術組比較，模型組大鼠Ang-2、VEGF陽性表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）提示腦缺血后會誘導血管新生;與模型組比較，針刺組Ang-2、VEGF陽性表達顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示在頭穴圍刺治療下血管新生明顯增多，且針刺組較模型組腦組織致密。見表2、圖2，3。

2.4 各組Western檢測結(jié)果

圖4從左至右灰度逐漸加深，說明大鼠腦損傷后，Ang-2、VEGF蛋白表達逐漸增加，而針刺介入后，Ang-2、VEGF蛋白表達增加更明顯。由此表明頭穴圍刺可明顯上調(diào)Ang-2、VEGF蛋白的表達，促進大鼠腦組織缺血半暗帶血管新生。

3 討論

腦缺血的治療中針灸作為一種臨床中廣泛應用的治療手段取得了良好的療效，并廣泛受到學者的重視。頭穴圍刺療法屬于一種特殊針法，它基于腦梗死區(qū)在大腦皮質(zhì)的投影區(qū)域通過腧穴治療作用的“近治作用”，以達到改善腦缺血的目的，其理論來自于《靈樞·官針》篇的楊刺，取其用4根針圍剿病灶集中治療的理論基礎。圍刺也是通過多根針刺圍剿病灶以產(chǎn)生“針場效應”來調(diào)整大腦皮質(zhì)功能，對于病灶集中圍刺以期在短時間內(nèi)縮小病灶減輕病損程度治療腦及神志相關性疾病。我們在早期研究中已證實頭穴圍刺不僅能夠減低腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損程度，還能上調(diào)內(nèi)源性神經(jīng)生長因子，起到保護腦神經(jīng)的作用。因此，本實驗采用頭穴圍刺療法對腦缺血再灌注大鼠模型進行干預，觀察其對血管生成因子及血管內(nèi)皮生長因子的影響，進一步探討頭穴圍刺法促進梗死區(qū)血管新生，改善梗死區(qū)血液供應，促進缺血半暗帶組織恢復，幫助代償梗死核心區(qū)循環(huán)功能，幫助快速建立有效血液循環(huán)，進而幫助受損的神經(jīng)功能快速回復，最大化降低后遺癥狀。

血管與神經(jīng)既各司其職又相輔相成，血管輸送具有營養(yǎng)物質(zhì)的血液以營養(yǎng)神經(jīng)，神經(jīng)在神經(jīng)元神經(jīng)細胞的作用下又對血管起到調(diào)節(jié)的功能，因此，二者關系緊密。梗死區(qū)血管堵塞，周圍血管出現(xiàn)系列炎性反映導致梗死中心及周圍血管狀態(tài)不佳，血液流通不暢，無法營養(yǎng)周圍的神經(jīng)細胞，進而出現(xiàn)了腦組織的壞死。腦梗死的梗死灶周圍存在半缺血區(qū)，我們稱之為半暗帶，這些微血管密度與腦中風患者的生存時間有密切關系，及時搶救半暗帶，開放側(cè)支循環(huán)已成為治療腦梗死的必要環(huán)節(jié)。因此，誘導有效血管再生對于治療腦梗死是一種有前景的方法[8]。VEGF是一種通過內(nèi)皮組織細胞可以特異的有絲分裂原，目前被認為是特異性最高、作用最強的促血管新生因子，它既可以使血管內(nèi)皮細胞增殖又可以促進形成新的血管，還可以改善已受損的神經(jīng)細胞成活狀態(tài)，營養(yǎng)并保護部分神經(jīng)，促使血管和神經(jīng)重塑，對腦梗死的恢復及預后發(fā)揮著重要作用[9-11]。

新生血管由很多細胞因子共同作用形成，血管生成素（ANG）就是血管新生家庭細胞因子重要組成部分[12-14]，而Ang-2就是Ang家族中的非常重要一員，它能夠調(diào)節(jié)血管收縮和痙攣，位于血管內(nèi)皮的表面，是血管新生后管腔調(diào)節(jié)的重要因子。梗死后血管收縮和調(diào)節(jié)直接影響梗死周圍供血環(huán)境，因此Ang-2可以改善腦梗死區(qū)供血狀態(tài)[15-16]，研究表明，Ang-2對VEGF互相影響互相促進，二者具有協(xié)同作用，對腦梗死受損后的組織有促進血管新生的作用。

本研究表明，頭穴圍刺治療21 d后大鼠梗死區(qū)組織形態(tài)較前致密，神經(jīng)細胞排列均勻組織形態(tài)完整，血管密度較前增加，管腔較前完整。VEGF和Ang-2的陽性細胞數(shù)及蛋白表達均明顯上升[17]。說明頭穴圍刺可以有效的促進梗死區(qū)血管新生，并且建立有效的血液供應，幫助損傷的腦組織恢復。

綜上所述，頭穴圍刺可通過上調(diào)VEGF和Ang-2表達，促進缺血腦組織血管新生，提升新生血管有效功能，重構(gòu)梗死區(qū)及缺血半暗帶區(qū)微循環(huán)系統(tǒng)，減輕大鼠腦部梗死面積，降低大鼠神經(jīng)功能損傷程度，為研究臨床治療腦梗死的機制提供一種新的的思路。但是本研究尚存不足，頭穴圍刺在梗死區(qū)重新建立起的血液循環(huán)及新生血管是否均為有效血管均能提供有效血供，尚需進一步實驗進行量化證明。

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