頭穴叢刺干預(yù)對腦出血大鼠神經(jīng)功能及腦組織含水量的影響?

邵文娜 邵佳凱 沈詩彥 崔 ?！?/p>

（1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

腦出血（ICH）是一種常見的腦卒中類型，其高致殘性、高死亡率及高發(fā)病率的特點(diǎn)已得到醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)可［1］。腦出血在中醫(yī)學(xué)屬于“中風(fēng)病”中的“出血性中風(fēng)”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對該病的治療方法不多，且療效并不理想，預(yù)后效果也不佳。近年來，關(guān)于針刺及電針治療ICH的研究大幅增加，但對于頭穴叢刺干預(yù)ICH的研究鮮有報(bào)道。本研究應(yīng)用頭穴叢刺激治療ICH大鼠，并采用改良神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評分及腦組織含水量的測定評價(jià)療效，初步探討其相應(yīng)的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量200～300 g，由首都醫(yī)科大學(xué)動物部提供［許可證號：SCXK（京）2016-0011］。分籠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動物房內(nèi)，溫度（23±2）℃，相對濕度40%～70%，光照周期為12 h光照/12 h黑暗，自由獲取食物和水。

1.2 試劑與儀器 1）試劑：膠原蛋白酶Ⅶ（C0773）（美國Sigma公司，1.5 KU，1000～3000 CDU/mg）；二甲亞砜（DMSO）（D5879）（美國Sigma公司，100 mL，98%）；選擇性抑制劑鋅原卟啉（ZPP-IX抑制劑）（Zn625-9）（美國Frontier公司，25 mg，96%）；75%酒精溶液（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，500 mL，75%）；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，500 mL，90%）。2）儀器：-20℃/4℃冰箱［中國青島海爾股份有限公司，BCD-290W（專供）］；0.01 g天平（德國Sartorius公司，TE412-L）；腦立體定位儀（深圳RWD Life Science公司，C4F04-001）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，101-0AB）；一次性無菌針灸針（云龍醫(yī)療器械公司，直徑0.25 mm，長度25 mm）。

1.3 分組及造模 72只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、假手術(shù)組、模型組、頭穴叢刺組、ZPP-IX抑制劑組、ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組，每組各12只，再分為1、3、7 d 3個(gè)亞組。采用Ⅶ膠原酶誘導(dǎo)制備大鼠腦出血模型［2-3］。在12 h禁食和4 h禁水后，用戊巴比妥鈉（300 mg/kg）通過腹腔給藥麻醉大鼠，待麻醉成功后將其備皮并固定在腦立體定位儀上，剪開頭皮，暴露前囟、冠狀縫和矢狀縫。在右側(cè)顱骨，于前囟后0.2 mm，右3 mm處，用鉆頭鉆一個(gè)1 mm的小孔，在大鼠尾狀核處用5 μL的微量注射器注入2 μL Ⅶ膠原酶（0.5 U/μL），深度5 mm，5 min內(nèi)分次注射完畢后（0.2 μL/30 s），留針5 min，隨后緩慢取出微量注射器，縫合傷口。待大鼠術(shù)后蘇醒后根據(jù)Longa評分法［4］。0分：無神經(jīng)缺陷；1分：未完全伸展左前爪；2分：向左旋轉(zhuǎn)；3分：倒向左邊；4分：沒有自發(fā)行走，意識水平低下，進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評分≥1分可認(rèn)為模型制備成功［4］。模型制備失敗及死亡的大鼠剔除實(shí)驗(yàn)，按照隨機(jī)抽樣原則選取大鼠重新造模。空白對照組不接受任何處理，假手術(shù)組造模鉆孔后在尾狀核處注入2 μL 0.9%氯化鈉注射液，模型組造模鉆孔后在大鼠尾狀核注入2 μL膠原酶。

1.4 干預(yù)方式 頭穴叢刺組進(jìn)行頭穴叢刺干預(yù)，取穴：根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》［5］，取百會穴及百會左右兩側(cè)2 mm的四神聰穴，用一次性無菌針灸針進(jìn)行針刺，留針30 min，每日1次，共7 d。ZPP-IX抑制劑組：造模術(shù)后30 min內(nèi)腹腔注射ZPP-IX抑制劑（10 mg/mL）。ZPP-IX+頭穴叢刺組：針刺同頭穴叢刺組，ZPP-IX抑制劑用法用量同ZPP-IX抑制劑組。其余各組不進(jìn)行針刺及藥物干預(yù)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 每組隨機(jī)選取3只于術(shù)后1、3、7 d過量麻醉后于冰面上斷頭處死，取腦組織稱質(zhì)量，各組1、3、7 d取腦組織后剩余的大鼠用于改良的神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）。用一次性無菌紗布稀釋表面多余水分與血漬后，放于天平稱質(zhì)量，為濕質(zhì)量；然后將腦組織放于60℃烘箱內(nèi)烘48～96 h，反復(fù)稱質(zhì)量直至質(zhì)量不再變化，為干質(zhì)量。腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)評分 測試由對實(shí)驗(yàn)分組不知情的觀察者進(jìn)行。mNSS測試包括：運(yùn)動、感覺、平衡和反射測試［6］。1）運(yùn)動測試：提起大鼠尾部，前肢屈曲記1分，后肢屈曲記1分，30 s內(nèi)在垂直軸頭移動＞10°記1分；將大鼠放在地板上，正常行走0分，不能走直線記1分，向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈記2分，倒向癱瘓側(cè)記3分。2）感覺測試：放置試驗(yàn)（視覺和觸覺測試）1分，本體感覺試驗(yàn)（深感覺，按壓大鼠爪子到桌子邊緣刺激肢體肌肉）1分。3）平衡測試即平衡木試驗(yàn)：姿勢穩(wěn)定平衡0分，緊抓平衡木邊緣記1分，緊抱平衡木且一肢體從其上面掉下記2分，緊抱平衡木且兩肢體從其上面掉下或在其上面旋轉(zhuǎn)（＞60 s）記3分，嘗試在平衡木上保持平衡但摔下（＞40 s）記4分，嘗試在平衡木上保持平衡但摔下（＞20 s）記5分，從不嘗試平衡或抓住平衡木便落下（＜20 s）記6分。4）反射測試：耳郭反射（觸及耳道時(shí)搖頭）記1分，角膜反射（當(dāng)用棉花觸及角膜時(shí)眨眼）記1分，驚嚇反射（對迅速敲擊木板發(fā)出短暫聲響的運(yùn)動反應(yīng)）記1分，癲癇發(fā)作，肌陣攣，肌張力障礙記1分［7］。mNSS神經(jīng)功能缺損的程度從0～18評分（正常評分，0；最大評分，18）。標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定如下：13～18分，嚴(yán)重傷害；7～12分，中度傷害；1～6分，輕傷；0分為正常，對傷害嚴(yán)重程度進(jìn)行評分時(shí)，無法進(jìn)行測試或缺乏測試反射可獲得1分［8］。得分越高，損傷越嚴(yán)重。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用方差分析進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及配對樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 見表1?？瞻讓φ战M與假手術(shù)組的各亞組均無明顯的神經(jīng)功能缺損，模型組、頭穴叢刺組、ZPP-IX抑制劑組和ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組均在術(shù)后第1天評分開始升高，第3天評分達(dá)到最高值，第7天明顯下降，頭穴叢刺組在1、3、7 d的神經(jīng)功能評分均低于頭穴叢刺組（P＜0.05或P＜0.01），ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組在1、3、7 d的神經(jīng)功能評分均低于ZPP-IX抑制劑組（P＜0.05或P＜0.01）。提示頭穴叢刺可以降低腦出血大鼠神經(jīng)功能評分，改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能。

表1 頭穴叢刺干預(yù)對腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響（分，±s）

表1 頭穴叢刺干預(yù)對腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響（分，±s）

與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，?P＜0.05，?P＜0.01；與ZPP-IX組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別空白對照組假手術(shù)組模型組頭穴叢刺組ZPP-IX抑制劑組ZPP-IX頭穴叢刺組n 6 6 6 6 6 61 d 0.00±0.000.00±0.0012.00±2.909.50±2.26*12.50±2.959.00±1.26△3 d 0.00±0.000.00±0.0013.83±1.9411.83±2.23*14.00±1.6711.67±1.21△△7 d 0.00±0.000.00±0.004.00±0.632.67±0.82**4.33±0.522.83±0.75△△

2.2 各組大鼠腦含水量比較 見表2?？瞻讓φ战M與假手術(shù)組的各亞組腦組織含水量無明顯差異，模型組、頭穴叢刺組、ZPP-IX抑制劑組和ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組均在術(shù)后第1天開始增加，第7天明顯回降，與模型組比較，頭穴叢刺組的腦含水量下降（P＜0.01），與ZPP-IX抑制劑組比較，ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組的腦含水量下降（P＜0.01）。提示頭穴叢刺可以降低腦出血大鼠腦組織含水量，對腦水腫起到抑制作用。

表2 頭穴叢刺干預(yù)對腦出血大鼠腦含水量的影響（%，±s）

表2 頭穴叢刺干預(yù)對腦出血大鼠腦含水量的影響（%，±s）

組別空白對照組假手術(shù)組模型組頭穴叢刺組ZPP-IX抑制劑組ZPP-IX頭穴叢刺組n 3 3 3 3 3 31 d 75.96±0.90**75.36±0.10**79.08±0.1476.98±0.28**79.42±0.3377.00±0.52△△3 d 76.03±1.1676.22±1.1680.02±0.0676.08±0.04**80.52±0.21**76.38±0.03△△7 d 74.60±0.54**74.16±0.14**78.39±0.4374.90±0.43**78.30±0.44**75.67±0.43△△

3 討論

腦出血是腦卒中的一種亞型，約占所有中風(fēng)死亡的15%，約75%的幸存者患有嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損［9-10］。在ICH后立即發(fā)生血腫周圍的腦水腫，并在幾天后出現(xiàn)峰值，如果不及時(shí)處理，嚴(yán)重者可破壞血腦屏障、減少腦血流量甚至引起腦萎縮［11-12］。針灸已被廣泛用作中風(fēng)患者的替代治療方法，針灸有多種生物反應(yīng)，包括循環(huán)和生化作用等，能在一定程度上緩解中風(fēng)患者的痛苦［13］。頭穴叢刺通過對前頭部、后頭部、側(cè)頭部腧穴的主治特點(diǎn)和作用規(guī)律的研究和總結(jié)，并借鑒超聲波治療原理提出了“針場”假說，在此基礎(chǔ)上基于傳統(tǒng)針灸療法治療中風(fēng)病的不足和頭部腧穴具有相互協(xié)同、綜合調(diào)節(jié)的作用，結(jié)合臨床實(shí)踐和大腦解剖生理功能而提出［14-15］。頭穴叢刺療法治療ICH效果顯著，此治療作用得到中醫(yī)針灸界的公認(rèn)［16］。有學(xué)者開展了頭穴針刺治療急性腦出血研究，表明腦出血急性期完全可以應(yīng)用頭穴針刺治療而且療效顯著，應(yīng)用頭穴針刺干預(yù)ICH越早者療效更加顯著，其恢復(fù)時(shí)間越快，后期恢復(fù)水平也相對較高，尤其即刻效應(yīng)和近期療效的效果更加明顯［17-18］。我們前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)頭穴叢刺法操作簡單、安全、療效好，但其治療機(jī)制至今未明。

本研究結(jié)果顯示ICH后腦組織含水量及神經(jīng)功能缺損評分在第3天達(dá)到最高值，而頭穴叢刺組及ZPPIX抑制劑+頭穴叢刺組有效降低了ICH大鼠的腦含水量及神經(jīng)功能評分，因此在ICH早期進(jìn)行頭穴叢刺治療，可有效降低ICH后的腦組織含水量，增加腦血流量，保護(hù)腦組織，使神經(jīng)功能得以改善。除此之外，我們認(rèn)為腦出血的作用機(jī)制可能與Nrf2通路下游的血紅素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）有關(guān)，頭穴叢刺在急性期進(jìn)行干預(yù)可能是通過下調(diào)Nrf2、HO-1、NQO1的含量而降低腦損傷。ZPP-IX抑制劑可以抑制HO-1的表達(dá)，從而增加腦組織的損傷，筆者設(shè)立ZPP-IX抑制劑組與模型組比較，ZPP-IX抑制劑組的神經(jīng)行為學(xué)評分增高，腦含水量升高，認(rèn)為可能與Nrf2通路下游的HO-1的表達(dá)被抑制有關(guān)；ZPP-IX抑制劑組與ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組比較，ZPP-IX抑制劑+頭穴叢刺組的神經(jīng)行為學(xué)評分降低及腦含水量下降的程度更顯著，說明頭穴叢刺可以對腦損傷起到保護(hù)作用。

綜上所述，頭穴叢刺作為一種獨(dú)特的針灸方式，可以在腦出血早期起到減少腦組織含水量、降低神經(jīng)功能評分的作用，對腦組織起到保護(hù)作用，但具體的作用機(jī)制還有待我們下一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)。