火針膝周密刺對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎鼠關(guān)節(jié)形態(tài)及軟骨LOXL2的影響

李濤 任景 李俐依

摘要 目的：探討火針膝周密刺對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）大鼠行為學(xué)、關(guān)節(jié)形態(tài)及軟骨中賴氨酰氧化酶相關(guān)蛋白2（LOXL2）影響性。方法：選擇30只健康雄性大鼠，10只作為對照不作任何處理。20只大鼠建立KOA模型，成模后隨機(jī)分成2組，分別予普通針刺和火針膝周密刺，1次/3 d，連續(xù)6次。觀察各組大鼠Leauesne MG評分、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞情況，外周血及關(guān)節(jié)軟骨轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、LOXL2水平變化。結(jié)果：治療后火針組Leauesne MG評分中的局部疼痛刺激反應(yīng)、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)腫脹度較對照組、模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。血清及關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、TGF-β1、TNF-α含量水平顯著低于模型組（P<0.05），LOXL2顯著高于模型組（P<0.05）。火針組電鏡下軟骨細(xì)胞形狀規(guī)則、細(xì)胞核完整且飽滿，微絨毛少量存在，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，有散在的染色質(zhì)。結(jié)論：火針膝周密刺能減輕K0A關(guān)節(jié)軟骨損傷，降低炎性反應(yīng)，改善軟骨LOXL2水平，這可能是火針治療KOA一個作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞? 火針膝周密刺;膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎;大鼠;行為學(xué);關(guān)節(jié)形態(tài);軟骨細(xì)胞;賴氨酰氧化酶相關(guān)蛋白2

Effect of Around knee Fire Needling on Joint Morphology and LOXL2 in Cartilage of Rats with Knee Osteoarthritis

LI Tao， REN Jing， LI Liyi

（Department of Acupuncture， Urumqi Chinese Medicine Hospital， Urumqi 830000， China）

Abstract Objective：To investigate the effect of fire needle acupuncture around the knee on behavior， joint morphology and lysyl oxidase related protein 2 （LOXL2） in cartilage of rats with knee osteoarthritis （Knee osteoarthritis，KOA）.Methods：30 healthy male rats were selected and 10 rats were used as control without any treatment.KOA model was established in 20 rats.After the model was established， the rats were randomly divided into two groups.They were treated with common acupuncture and around knee fire needling respectively， once every 3 days for 6 consecutive times.The Leauesne MG score， articular chondrocytes and the levels of transforming growth factor-β 1 （TGF-β 1）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， matrix metalloproteinase-3 （MMP-3） and LOXL2 in peripheral blood and articular cartilage were observed.Results：After treatment， the local pain stimulation response， gait， joint range of motion and joint swelling of the Leauesne MG scoring in the fire needling group were significantly different from those in the control group and the model group （P<0.05）.The levels of MMP-3， TGF-β 1 and TNF-α in serum and articular cartilage in the fire needling group were significantly lower than those in the model group（P<0.05）， while LOXL2 was significantly higher than that in the model group（P<0.05）.Under electron microscope， the chondrocytes in the fire needling group had regular shape， complete and full nucleus， a small amount of microvilli， abundant endoplasmic reticulum and scattered chromatin.Conclusion：Fire needling around the knee can reduce the injury of K0A articular cartilage， reduce the inflammatory reaction and improve the level of cartilage LOXL2， which may be one of the mechanisms of fire needling in the treatment of KOA.

Keywords Around knee fire needling; Knee osteoarthritis; Rats; Behavior; Joint morphology; Chondrocyte; Lysyl oxidase-related protein 2

中圖分類號：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.007

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是臨床上常見慢性退行性疾病，臨床病理改變以關(guān)節(jié)軟骨管進(jìn)行性變性、破壞，且呈骨質(zhì)增生反應(yīng)為主，臨床癥狀常表現(xiàn)為：關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動障礙等。隨著我國老齡化程度的加深，KOA患者呈不斷上升之勢，嚴(yán)重影響患者及其家屬的生命質(zhì)量，增加家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及國家醫(yī)療支出。如何防治KOA成為骨科醫(yī)師所面臨的重要課題之一。本病防治的關(guān)鍵在于避免或者延緩或者逆轉(zhuǎn)軟骨細(xì)胞變性、凋亡過程。中醫(yī)將膝骨關(guān)節(jié)炎劃為痹證范疇，八綱辨證認(rèn)為風(fēng)、寒、濕是導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)阻滯不通而發(fā)病[1]。針刺作為中醫(yī)治療重要組成部分，具有疏通經(jīng)絡(luò)氣血、消腫止痛功效，療效顯著?；疳樖轻樉囊环N集經(jīng)絡(luò)、穴位、針法、灸法為一體的復(fù)合性治療方法，具有溫經(jīng)散寒、消腫止痛、舒筋通絡(luò)，能顯著改善KOA臨床癥狀。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上看，火針可調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)、植物神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等，通過增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞和體液免疫以促進(jìn)代謝和細(xì)胞修復(fù)?；疳樦苯訉Σ≡詈头瓷潼c(diǎn)進(jìn)行刺激，達(dá)到改善局部組織水腫、充血、鈣化等病理促進(jìn)局部組織循環(huán)，消除臨床癥狀、修復(fù)受損組織神經(jīng)而激發(fā)自身對壞死組織吸收，松解粘連組織，促進(jìn)血液循環(huán)[2-3]。本研究模擬人體局部進(jìn)展過程，以關(guān)節(jié)制動法制作大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎，模型，使用火針膝周密刺進(jìn)行治療，從行為學(xué)、關(guān)節(jié)形態(tài)、軟骨細(xì)胞含量測定等方面整體評估火針治療的臨床療效，探討其可能的作用機(jī)制，為臨床治療方案的選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

30只健康雄性大鼠，體質(zhì)量平均為（245±21）g，均為SPF級，由上海交通大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（許可證為SCKX（滬）2017-002），飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±1.5）℃，濕度（50±1）%，12 h/12 h晝夜交替，試驗(yàn)期間處理流程嚴(yán)格按照《關(guān)于善待動物試驗(yàn)的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行。所有試劑盒均購自上海尚?？萍加邢薰荆疳槻捎帽本┽樉难芯克?，石膏繃帶購自杭州依諾醫(yī)療衛(wèi)生用品有限公司，相關(guān)檢測儀器為本院實(shí)驗(yàn)室自有設(shè)備設(shè)施。

1.1.2 試劑與儀器

血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）ELISA試劑盒（上海齊一生物科技有限公司，貨號：QY-R2746）;腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（艾美捷科技有限公司，貨號：K1052-100）;基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號：293323）;賴氨酰氧化酶相關(guān)蛋白2（LOXL2）（上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，貨號：788323），戊二醛（德州格利潔消毒制品有限公司，批號：283932）。恒溫培養(yǎng)箱（杭州碩聯(lián)儀器有限公司，ZLC-50型）

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 10只健康雄性大鼠作為對照不作任何處理。20只健康雄性大鼠建立KOA模型。建模方法：大鼠禁食12 h后造模，局麻下沿著大鼠后肢髖關(guān)節(jié)刮除鼠毛至腳趾處，將大鼠踝關(guān)節(jié)呈背屈70°～90°并用紗布綁緊固定，將膝關(guān)節(jié)背展呈160°～180°并用紗布綁緊固定，石膏沿著大鼠腹股溝纏繞至后肢，露出腳趾并采用繃帶固定，6周后拆除繃帶。造模期間每日早晚2次對大鼠進(jìn)行觀察，確保大鼠制動良好，捆綁處無瘀血。造模時間完成后對大鼠的行為學(xué)、后肢腫脹、局部壓痛程度等進(jìn)行觀察。確認(rèn)造模成功后，再隨機(jī)將模型大鼠平均分成2組，分別為模型組和火針針。

1.2.2 干預(yù)方法 對照組大鼠和模型組大鼠予以正常飼喂、觀察。火針組大鼠則每3 d行火針針刺治療1次。分別于治療前在大鼠的膝前穴、阿是穴、陽陵泉穴涂抹萬花油，采用0.45 mm×0.45 mm號賀氏火針，將火針在酒精外焰燒至紅白，對上述穴位分別進(jìn)行點(diǎn)刺，點(diǎn)刺深度以2 mm為宜，每個穴位點(diǎn)刺3～4次為宜，點(diǎn)刺后快速拔除火針即刻用干棉球按壓針孔2～3 s，火針組大鼠共行火針針刺6次。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 Leauesne MG評分 由同一位經(jīng)過培訓(xùn)的醫(yī)師參照MG評分量表對大鼠造模成功后、完成火針治療后行MG評分，評分分4個項(xiàng)目，分別為局部疼痛刺激反應(yīng)、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)腫脹度。上述4個維度均采用likter4級評分法對其嚴(yán)重程度分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級，分級越高說明癥狀越嚴(yán)重[4-5]。

1.2.3.2 標(biāo)本采集 大鼠行脫頸處死，采集腹主動脈血液離心得上層血清，液氮凍存后置-80 ℃冰箱保存。將大鼠固定，膝關(guān)節(jié)充分伸展，剜出膝關(guān)節(jié)，用0.9%的氯化鈉溶液沖洗軟骨平面，置于4%中性甲醛中保存。

1.2.3.3 血清學(xué)檢測 取血清標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）變化并比較。

1.2.3.4 軟骨組織檢測 取膝關(guān)節(jié)軟骨組織，稱重后用以1∶9軟骨組織：生理鹽水比率進(jìn)行混勻，在]4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上層清液，按放射免疫法檢測軟骨組織MMP-3、TGF-β1、TNF-α、賴氨酰氧化酶相關(guān)蛋白2（LOXL2）含量水平。

1.2.3.5 電鏡下大鼠形態(tài)學(xué)觀察 將取膜下來的膝關(guān)節(jié)軟骨制作成1.5 mm×1.5 mm，用2.5%戊二醛固定，采用濃度15%的依地酸二鈉溶液脫鈣3周，行常規(guī)電鏡切片，對軟骨細(xì)胞的形態(tài)、膠原纖維排列狀況等與電鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以]P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠行為學(xué)比較 試驗(yàn)前對照組和其他2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型組和火針組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），火針組大鼠治療后局部疼痛刺激反應(yīng)、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)腫脹度Ⅰ度、Ⅱ度比率顯著高于模型組（]P<0.05），對照組和模型組、火針組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 3組電鏡下軟骨組織所示比較 對照組大鼠軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，絨毛較多，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少量，細(xì)胞核完整，染色質(zhì)均勻分布，見圖1a;膠原纖維粗細(xì)不等，排列整齊，可見周期橫紋，見圖2a。模型組軟骨細(xì)胞不規(guī)則，表面微絨毛消失，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)消失，有大量空泡，細(xì)胞核破裂，染色質(zhì)濃聚，見圖1b;膠原纖維斷裂、溶解，橫紋消失，見圖2b?；疳樈M治療6周后電鏡下示細(xì)胞形狀規(guī)則、細(xì)胞核完整且飽滿，微絨毛少量存在，胞質(zhì)具有較為豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有散在的染色質(zhì)，見圖1c;膠原纖維粗細(xì)不均勻，排列紊亂，有部分壞死纖維，見圖2c。

2.3 3組血清學(xué)指標(biāo)比較

對照組、模型組試驗(yàn)前、試驗(yàn)6周后MMP-3、TGF-β1、TNF-α比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組、火針組試驗(yàn)前在MMP-3、TGF-β1、TNF-α上較對照組均顯著升高（]P<0.05），治療6周后火針組MMP-3、TGF-β1、TNF-α較試驗(yàn)前均顯著下降（P<0.05），且火針組顯著低于模型組（P<0.05）。見表2。

2.4 3組軟骨組織指標(biāo)比較

對照組、模型組試驗(yàn)前、試驗(yàn)6周后軟骨組織MMP-3、TGF-β1、TNF-α、LOXL2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組、火針組試驗(yàn)前在MMP-3、TGF-β1、TNF-α上較對照組均顯著升高，LOXL2均顯著下降（P<0.05），治療6周后火針組MMP-3、TGF-β1、TNF-α較試驗(yàn)前均顯著下降，LOXL2則顯著升高（P<0.05），火針組顯著優(yōu)于模型組（P<0.05）。見表3。

3 討論

KOA是一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，患者關(guān)節(jié)腫脹疼痛，活動障礙，是嚴(yán)重影響患者日常生活及工作的疾病。近些年隨著老齡化社會加劇，KOA發(fā)病率呈逐年升高趨勢。臨床研究證實(shí)，膝蓋軟骨所具有的合成降解因子的能力下降，以及反復(fù)炎性反應(yīng)是導(dǎo)致KOA發(fā)生的重要原因之一。中醫(yī)將KOA歸屬為“骨痹”“膝痹”范疇，因年老體衰、筋骨失養(yǎng)，氣血失調(diào)，或跌打損傷，瘀血閉阻經(jīng)脈，或寒濕之邪流注關(guān)節(jié)，促使氣血瘀閉發(fā)為此病。針灸作為中醫(yī)學(xué)重要的疾病治療手段，其在臨床關(guān)節(jié)疾病的治療中發(fā)揮重要作用。其具有疏通經(jīng)絡(luò)氣血、消腫止痛的功效?！夺樉木塾ⅰ吩弧胺舶Y塊結(jié)積之病，甚宜火針”?？梢娀疳樋蓽亟?jīng)通脈，振奮正氣?；疳樋蓪崃坑醚ㄎ粊韨鲗?dǎo)。借助外來火鼓動內(nèi)生火，振奮陽氣，達(dá)到祛風(fēng)散寒、除濕祛痹作用[6-7]。火針膝周密刺法則密集性用火針對病灶區(qū)域進(jìn)行針刺，用足夠熱量改變局部氣血，促進(jìn)新陳代謝。遵循“快、準(zhǔn)、紅”原則，當(dāng)針尖直達(dá)骨面后迅速出針，快速提插刺激骨膜產(chǎn)生針感密集針刺[8]。在本次穴位選擇上，陽陵泉穴作為筋病治療的要穴，通過火針點(diǎn)刺發(fā)揮強(qiáng)健腰膝、壯筋補(bǔ)虛的功效;膝前穴位和阿是穴是膝關(guān)節(jié)經(jīng)絡(luò)匯聚質(zhì)地，通過點(diǎn)刺發(fā)揮疏通局部經(jīng)氣，能行氣活血通絡(luò)的功效。而火針針刺以上穴位有雙重作用，能發(fā)揮針刺本身作用，又有火針刺激皮膚產(chǎn)生直接灸作用[9]。火針是針和灸的完美雙重結(jié)合，有針、熱雙重性，通過熱量傳導(dǎo)能溫經(jīng)通脈、振奮陽氣，達(dá)到祛寒除濕、通經(jīng)止痛功效[10]。

報(bào)道稱，火針通過熱量傳導(dǎo)可使KOA大鼠的毛細(xì)血管再一次范圍內(nèi)擴(kuò)張，達(dá)到促進(jìn)微循環(huán)，提升大循環(huán)及淋巴循環(huán)的目的，促進(jìn)炎性物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和排泄，達(dá)到加強(qiáng)止痛功效[11-12];研究通過對火針進(jìn)行紅外熱像圖發(fā)現(xiàn)，針刺能促使局部血液循環(huán)增快，血流狀態(tài)好轉(zhuǎn)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，火針能提高病灶區(qū)域酶活性，升高鎂、鋅含量，即改善新陳代謝，增強(qiáng)機(jī)體活力，促進(jìn)充血水腫、粘連瘢痕組織松軟，針刺時高溫能破壞局部壞死組織，激發(fā)機(jī)體自身對物質(zhì)]吸收[14-15]。

MMP-3是MMPs家族成員之一，在KOA關(guān)節(jié)炎、心血管疾病中發(fā)揮重要作用。MMP-3通過刺激軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分解酶，可促進(jìn)軟骨代謝，加重膝關(guān)節(jié)損傷其能[16]。TGF-β1也具有加速細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)降解的作用，還對單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有驅(qū)化作用而促進(jìn)成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞生長，該指標(biāo)和骨性關(guān)節(jié)炎息息相關(guān)，是病情加重的重要促進(jìn)因素[17]。TNF-α對軟骨細(xì)胞有較強(qiáng)的分解能力，抑制軟骨基質(zhì)合成。有報(bào)道稱，TNF-α可合成E2，而前列腺E2能分解軟骨，誘導(dǎo)激活MMPs，對軟骨基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重阻礙性[18]。LOXL2屬于LOXL家族，其能催化膠原和彈性蛋白中賴氨酰氧化脫氨，能縮合反應(yīng)形成分子內(nèi)和分子間交叉連接，這種連接將膠原和彈性蛋白可溶性單體轉(zhuǎn)變?yōu)榘|(zhì)中高度穩(wěn)定的不溶性纖維，增加膠原和彈性纖維機(jī)械強(qiáng)度，能抵抗蛋白酶水解作用[19-20]。

結(jié)果顯示，KOA模型建立后電鏡下可見軟骨細(xì)胞排列紊亂，軟骨表面粗糙，行為學(xué)上表現(xiàn)為疼痛、關(guān)節(jié)腫脹、活動受限。而火針膝周密刺治療KOA能改善大鼠行為學(xué)，緩解局部壓痛，減輕腫脹，改善關(guān)節(jié)活動度和步態(tài)，可在很大程度上改善軟骨排列情況，改善軟骨表面光滑度，緩解疼痛，從而達(dá)到治療目的。而從火針治療后MMP-3、TGF-β1、TNF-α較建模時的含量顯著下降，LOXL2則顯著升高，結(jié)合各指標(biāo)的臨床意義，可能火針通過抑制KOA大鼠膝周炎性反應(yīng)，從而保護(hù)軟骨組織細(xì)胞有關(guān)，重新恢復(fù)膠原細(xì)胞纖維活性有關(guān)。但本次研究對各個指標(biāo)之間關(guān)聯(lián)性未明確，這有待進(jìn)一步探討。

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