參麻益智方對多發(fā)腦梗血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能和腦白質(zhì)損傷的影響

李澤惠 曹宇 劉佳妮 劉美霞 裴卉 李浩

摘要 目的：研究參麻益智方對血管性癡呆（VD）模型大鼠認(rèn)知功能和腦白質(zhì)損傷的影響。方法：將60只Wistar大鼠經(jīng)造模手術(shù)后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、參麻益智方低劑量組、參麻益智方中劑量組、參麻益智方高劑量組和多奈哌齊組。給藥2周后行水迷宮實(shí)驗檢測大鼠的認(rèn)知功能，腦組織LFB染色觀察胼胝體髓鞘脫失情況并進(jìn)行腦白質(zhì)損傷評分，]Western blot法檢測MBP蛋白表達(dá)。結(jié)果：參麻益智方高劑量組大鼠水迷宮逃避潛伏期明顯縮短，目標(biāo)象限停留時間明顯延長，腦白質(zhì)損傷評分明顯降低，MBP表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論：參麻益智方可以改善VD大鼠的認(rèn)知功能，減輕VD大鼠的腦白質(zhì)損傷。

關(guān)鍵詞? 血管性癡呆;多發(fā)腦梗;參麻益智方;腦白質(zhì);髓鞘

Effect of Shenmayizhi Decoction on Cognitive Function and White Matter Damage in Multiple Cerebral Infarction VD Rats

LI Zehui， CAO Yu， LIU Jiani， LIU Meixia， PEI Hui， LI Hao

（Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China）

Abstract Objective：To study the effect of Shenma Yizhi Decoction （SMYZD） on cognitive function and white matter lesions in VD rats.Methods：A total of 60 surgery modeled Wistar rats were randomly divided into Sham group， Model group， SMYZD-L group， SMYZD-M group， SMYZD-H group and Donepezil group.After 2 weeks administration of SMYZD， Morris water maze test was used to detect cognitive function of rats.Brain tissue LFB staining was used to observe loss of myelin sheath of the Corpus callosum and White matter damage scoring.Western blot was used to detect the expression of myelin basic protein （MBP）.Results：Escape latency of rats in SMYZD-H group significantly shortened.Time spent in target quadrant significantly prolonged.Grading score of white matter damage significantly diminished， and MBP expression augmented.Conclusion：Shenma Yizhi Decoction could improve cognitive dysfunction and alleviate white matter damage of VD rats.

Keywords Vascular dementia; Multiple cerebral infarction; Shenma Yizhi Decoction; White matter; Myelin sheath

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.006

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是在各種腦血管病和心血管病引起的缺血缺氧性腦組織損害基礎(chǔ)上產(chǎn)生的一種嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙性疾病。其臨床表現(xiàn)為社會生活能力、認(rèn)知、記憶和思維等能力的減退，并伴隨情感、人格的改變[1-2]。前期臨床研究表明，參麻益智方可以改善VD患者的認(rèn)知功能障礙，但其作用機(jī)制尚不甚明確。腦白質(zhì)脫髓鞘改變是臨床上VD患者常見的影像學(xué)表現(xiàn)之一[3-4]，本研究采用多發(fā)性腦梗死模型，從腦白質(zhì)脫髓鞘改變?nèi)胧郑接憛⒙橐嬷欠綄D大鼠認(rèn)知功能和腦白質(zhì)損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級10周齡體質(zhì)量（300±20）g的雄性Wistar大鼠60只，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于本院的實(shí)驗動物室，溫度（23±2）℃，濕度（50±10）%，人工光照明暗各12 h，自由取用基礎(chǔ)飼料]和水。

1.1.2 藥物 參麻益智方由人參9 g、天麻9 g、鬼箭羽9 g、川芎6 g組成。實(shí)驗所用中藥水煎濃縮劑由西苑醫(yī)院制劑室提供，于4 ℃冰箱保存。多奈哌齊（衛(wèi)材中國藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050978）。

1.1.3 試劑與儀器 聚苯乙烯微球（美國Polysciences公司，貨號：9003-53-6#684020）;兔抗大鼠MBP多克隆抗體（Proteintech公司，貨號：10458-1-AP）;兔抗大鼠beta Actin多克隆抗體（Proteintech公司，貨號：20536-1-AP）;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Proteintech公司，貨號：10285-1-AP）;Morris水迷宮系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)公司，ZS-001型）;超純水機(jī)（美國Millipore公司，Mili-Q型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 對大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參考Moriyama等的方法[5]，行微球注射造模手術(shù)，過程簡述如下：術(shù)前禁食，以2%戊巴比妥鈉]40 mg/kg腹腔注射麻醉。仰臥固定，以碘伏消毒頸部，行正中切口約1.5 cm。鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露出頸總動脈所行的位置。仔細(xì)分離右側(cè)頸總動脈，注意不傷及迷走神經(jīng)，然后繼續(xù)向上分離頸外動脈。用小號動脈夾小心夾閉頸總動脈，用手術(shù)線結(jié)扎頸外動脈的遠(yuǎn)心端。以1 mL注射器從頸外動脈勻速、緩慢地向頸內(nèi)動脈注入右旋糖酐溶液稀釋的聚苯乙烯微球溶液0.2 mL（假手術(shù)組注入]0.2 mL右旋糖酐溶液）。拔出注射器，隨即將頸外動脈近心端結(jié)扎，并松開頸總動脈上的動脈夾。逐層縫合，待蘇醒后送回籠。術(shù)后24 h對大鼠進(jìn)行Zea Longa神經(jīng)功能缺損評分[6]：無神經(jīng)功能缺失癥狀計為0分;不能完全伸展對側(cè)前爪計為1分;向外側(cè)轉(zhuǎn)圈即追尾計為2分;向?qū)?cè)傾倒計為3分;不能自發(fā)行走或意識喪失計為4分。選擇1～3分的大鼠進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗。將模型建造成功的大鼠隨機(jī)分入模型組、參麻益智方低劑量組、參麻益智方中劑量組、參麻益智方高劑量組和多奈哌齊組，每組10只。假手術(shù)組每組10只。

1.2.2 給藥方法 按大鼠與人體表面積換算方法計算給藥量，參麻益智方低劑量組予3.3 g/（kg·d）灌胃，參麻益智方中劑量組予6.6 g/（kg·d）灌胃，參麻益智方高劑量組每天予16.5 g/kg灌胃，多奈哌齊組予0.5 mg/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和模型組每天予等量蒸餾水灌胃，共給藥14 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 認(rèn)知功能評價 采用Morris水迷宮實(shí)驗檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。正式開始實(shí)驗前1 d，將大鼠放入水中適應(yīng)性游泳1次。實(shí)驗前5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗，將平臺置于第一象限（西南）。將大鼠頭朝池壁，隨機(jī)從東南、南、東、西北4個方位之一放入水中。記錄大鼠游泳的路程和時間。以大鼠找到水中平臺的時間即逃避潛伏期作為大鼠學(xué)習(xí)能力的檢測指標(biāo)。在每次訓(xùn)練中，若時間超過90 s，則引導(dǎo)大鼠到平臺上停留10 s。每日每只大鼠訓(xùn)練4次，每2次訓(xùn)練間隔15 min。第六日將平臺撤除，進(jìn)行空間探索實(shí)驗。入水點(diǎn)選擇原平臺位置的對側(cè)（東北），以大鼠在目標(biāo)象限（即原平臺所在象限）停留時間作為大鼠空間記憶的檢測指標(biāo)。

1.2.3.2 取材 水迷宮實(shí)驗結(jié)束后第2天，以2%的戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉全部大鼠。從每組隨機(jī)取5只進(jìn)行灌注固定：仰臥固定，開胸后暴露心臟，用注射器針頭由心尖插入左心室，快速灌注4 ℃預(yù)冷的PBS溶液約100 mL至肝臟無血色，隨后灌注4%多聚甲醛溶液（4 ℃預(yù)冷），至尾部和肢體僵直，立即開顱取腦，迅速將大腦浸泡于4%多聚甲醛溶液，24 h后，進(jìn)行石蠟包埋，5 μm切片備用。其余大鼠麻醉后開腹，經(jīng)腹主動脈取血，隨后立即取腦，將右側(cè)腦組織置于液氮冰凍后放入-80 ℃冰箱保存，待行Western Blot檢測。

1.2.3.3 盧卡斯快藍(lán)（Luxol Fast Blue，LFB）染色和腦白質(zhì)損傷評分 腦組織切片脫蠟后放入0.1%LFB染液，56 ℃孵育過夜，95%乙醇洗掉多余染色液后轉(zhuǎn)入蒸餾水洗，用0.05%碳酸鋰和70%乙醇分色至灰白質(zhì)分辨明顯，隨后梯度脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腦胼胝體區(qū)白質(zhì)損傷情況并進(jìn)行評分：正常髓鞘形態(tài)記為0分;髓鞘紊亂、染色變淺記為1分;髓鞘斷裂，明顯的空泡形成記為2分;髓鞘不能顯示陽性染色記為3分[7]。

1.2.3.4 Western Blot檢測 取凍存的大鼠腦組織每只約20 mg，冰上操作，加入0.3 mL含1%PMSF的RIPA裂解液，超聲勻漿后，4 ℃，10 000×g離心]5 min。取上清液進(jìn)行蛋白濃度測定（BCA法）。取蛋白樣品經(jīng)12.5%的SDS-PAGE膠分離，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（1∶2 000稀釋），4 ℃過夜，TBST洗滌3次，加入二抗（1∶10 000稀釋），室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，ECL法顯影。以β-actin為內(nèi)參，分析各條帶的相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0和Graphpad軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，水迷宮數(shù)據(jù)的分析采用重復(fù)測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知功能比較 各組大鼠逃避潛伏期呈逐天遞減趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），目標(biāo)象限停留時間明顯縮短（P<0.05），提示多發(fā)腦梗大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受到損害。與模型組比較，參麻益智方高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），目標(biāo)象限停留時間明顯延長（P<0.05），提示參麻益智方能夠改善多發(fā)腦梗大鼠的認(rèn)知功能損害。見圖1。

2.2 腦白質(zhì)損傷程度比較 經(jīng)LFB染色，假手術(shù)組胼胝體神經(jīng)纖維排列整齊、致密，髓鞘呈藍(lán)色;模型組胼胝體神經(jīng)纖維稀疏彎曲、排列紊亂，有空泡形成，髓鞘著色變淺。與假手術(shù)組比較，模型組白質(zhì)損傷評分明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，參麻益智方高劑量組腦白質(zhì)損傷評分明顯降低（P<0.05）。見圖2。

2.3 各組腦組織髓鞘堿性蛋白（Myelin Basic Protein，MBP）表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織中MBP的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，多奈哌齊組和參麻益智方高劑量組的MBP表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），參麻益智方低劑量組和中劑量組的MBP表達(dá)水平有升高趨勢（P>0.05）。見圖3。

3 討論

血管性癡呆屬中醫(yī)學(xué)“呆病”“健忘”等范疇，現(xiàn)代醫(yī)家總結(jié)其病變在腦，其發(fā)病涉及腎、肝、脾等臟腑，其病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)，以臟腑虧虛、氣血不足為本，痰、瘀、濁毒等病理產(chǎn)物蒙蔽腦竅為標(biāo)?！鹅`樞》中有“五十歲肝氣始衰……七十歲脾氣虛，皮膚枯。八十歲肺氣衰，魄離，言善誤”之言，其中“言善誤”乃癡呆的一種表現(xiàn)，推之元?dú)馓撍ナ菍?dǎo)致癡呆的病因之一?！秱摗分杏小瓣柮髯C，其人善忘……本久有瘀血，故令喜忘”，指出健忘可由瘀血造成，其治以抵當(dāng)湯祛除瘀血。氣血不足則腦府失養(yǎng);腎主骨生髓，腎精不足則腦髓不充;肝腎陰虧，則陽失陰制，亢盛于上，擾亂清空;肝失疏泄則氣機(jī)不暢，氣行則血行，氣滯則血瘀;脾虛則水濕失于運(yùn)化，停滯而成痰濁;血瘀、痰濁進(jìn)一步蒙蔽腦竅，日久更能釀為濁毒。治療上多以補(bǔ)虛瀉實(shí)、標(biāo)本兼顧為基本治療原則[8]，主要為補(bǔ)氣、活血、補(bǔ)腎陰、平肝陽、祛瘀血、化痰濁等。

參麻益智方是由本院周文泉老教授治療血管性癡呆的經(jīng)驗方改良而來的，由人參、天麻、鬼箭羽和川芎四味藥組成。人參能夠大補(bǔ)元?dú)?，安神增智。如《本草匯言》稱人參能補(bǔ)氣生血，助精養(yǎng)神。《神農(nóng)本草經(jīng)》言人參能補(bǔ)五臟，開心益智。天麻滋陰潛陽而平肝?！侗静輩R言》稱天麻“主頭風(fēng)，頭痛……語言不順，一切中風(fēng)，風(fēng)痰”。鬼箭羽能夠破血祛瘀，行血通經(jīng)。川芎活血行氣并引諸藥上行于腦。此四藥合用，共奏補(bǔ)虛增智，活血平肝之效，用于血管性癡呆之氣虛血瘀、肝陽上亢證。團(tuán)隊已用高效液相色譜法對參麻益智方總提取物進(jìn)行了藥物成分測定，結(jié)果共檢測到包括人參皂苷Rg1、Rb1、Re、天麻素、槲皮素、阿魏酸5種入腦成分的11種主要成分[9]。

Loeb等[10]將VD分為8種類型，主要有多發(fā)性梗死所致的癡呆、關(guān)鍵部位梗死所致的癡呆、多發(fā)性皮質(zhì)下腔隙損害所致的癡呆、出血性病灶所致的癡呆和Alzheimer病與VD混合的混合型癡呆等。本研究采用聚苯乙烯微球腦內(nèi)注射誘導(dǎo)多發(fā)性腦梗死模型，可以模擬多發(fā)梗死性癡呆這一類型[11]。本研究的行為學(xué)實(shí)驗結(jié)果表明模型大鼠具有認(rèn)知功能的損害，說明此模型作為血管性癡呆的模型建造成功。而參麻益智方干預(yù)后可見大鼠的認(rèn)知功能得到改善，表明參麻益智方對于血管性癡呆具有治療]作用。

腦白質(zhì)損傷是血管性癡呆的常見病理表現(xiàn)之一[12-13]。腦白質(zhì)作為大腦皮質(zhì)處理信息的補(bǔ)充，有助于大腦的信息傳遞，使神經(jīng)系統(tǒng)具有快速高效的整合能力，對于人的認(rèn)知功能十分重要[14]。而腦白質(zhì)由于具有較少的側(cè)支循環(huán)，較灰質(zhì)更易受到缺血損害[15]。胼胝體是大腦最大的白質(zhì)帶，較易進(jìn)行觀察和比較，因此本研究選擇對胼胝體的觀察來進(jìn)行各組大鼠的腦白質(zhì)損傷的比較。

腦白質(zhì)主要由神經(jīng)元軸突、包饒軸突的髓鞘和膠質(zhì)細(xì)胞組成。其中髓鞘具有支持軸突和絕緣的作用，保證了沖動的傳導(dǎo)。腦白質(zhì)受損可表現(xiàn)為髓鞘的曲折、斷裂或完全消失等[16]。盧卡斯快藍(lán)（LFB）是一種可以將髓鞘染為藍(lán)色的染料，可以方便觀察髓鞘的結(jié)構(gòu)。我們利用LFB染色觀察胼胝體髓鞘的形態(tài)和脫失情況，結(jié)果顯示與假手術(shù)組比較，模型組髓鞘染色變淺，神經(jīng)纖維變得稀疏、雜亂，有髓鞘脫失，說明多發(fā)腦梗手術(shù)能夠造成腦白質(zhì)的脫髓鞘損傷;而參麻益智方干預(yù)后腦白質(zhì)損傷評分較模型組明顯降低，提示參麻益智方對腦白質(zhì)髓鞘具有保護(hù)作用。

髓鞘堿性蛋白MBP是位于髓鞘漿膜面的一種膜蛋白，約占髓鞘蛋白總量的1/3，其含量的高低可以反映脫髓鞘病變的嚴(yán)重程度，是評價脫髓鞘的嚴(yán)重程度和髓鞘再生情況的重要指標(biāo)[17-18]。我們用Western blot法檢測了腦組織MBP的表達(dá)在各組間的差異。結(jié)果顯示，模型組MBP表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，說明多發(fā)腦梗模型存在脫髓鞘損傷;參麻益智方干預(yù)后MBP的表達(dá)明顯升高，表明參麻益智方能夠改善腦缺血損傷所致的腦白質(zhì)脫髓鞘改變。

綜上所述，聚苯乙烯微球腦內(nèi)注射誘導(dǎo)的大鼠多發(fā)性腦梗死模型可以作為研究腦白質(zhì)脫髓鞘改變的動物模型。參麻益智方能夠改善血管性癡呆模型大鼠的認(rèn)知功能，其改善認(rèn)知功能的機(jī)制可能是通過對腦白質(zhì)髓鞘的保護(hù)。

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