三種方法聯(lián)合檢測診斷結(jié)核性胸腔積液60例臨床研究*

王科文，吳勝波，馬紀(jì)龍，張 寧，劉 莉△

1.解放軍聯(lián)勤保障部隊987醫(yī)院結(jié)核科(寶雞 721006)；2.解放軍陸軍第946醫(yī)院(伊犁 835000)；3.陜西省結(jié)核病防治院(西安 710100)

胸膜疾病最常見的臨床表現(xiàn)是胸腔積液，據(jù)統(tǒng)計我國每年胸腔積液發(fā)病患者約672萬，分為漏出液和滲出液。滲出性胸腔積液最常見于結(jié)核性胸腔積液(Tuberculous pleural effusion，TPE)和非TPE(主要是類肺炎性胸腔積液和惡性胸腔積液)。我國既往大樣本胸腔積液數(shù)據(jù)資料顯示TPE約占46.7%[1]，因胸水涂片及結(jié)核菌培養(yǎng)陽性率均低，胸腔鏡下胸膜活檢盡管陽性率高，但技術(shù)要求高，價格昂貴且為有創(chuàng)檢查[2]，難以在廣大中小型醫(yī)院普及。γ-干擾素釋放試驗(IGRA)和結(jié)核菌核糖核酸(TB-RNA)是近年興起的兩種新的結(jié)核病輔助診斷技術(shù)，兩者單一應(yīng)用時存在一定局限性，二者聯(lián)合胸水腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase,ADA)可極大提高TPE的診斷準(zhǔn)確率，且易于在臨床開展?，F(xiàn)通過回顧性分析2017年10月至2019年11月我院采用上述三種方法用于臨床診斷TPE，并探討三者聯(lián)合檢測在其診斷中的價值，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1 一般資料 選取2017年10月至2019年11月解放軍聯(lián)勤保障部隊987醫(yī)院結(jié)核科收治的胸腔積液患者103例。研究臨床診斷為TPE患者60例，納入TPE組，其中男49例，女11例，年齡18～79歲，平均(38.9±11.2)歲。對照組為非TPE患者43例(其中惡性胸腔積液28例，類肺炎性胸腔積液6例，其他原因9例)，全部經(jīng)過胸水細(xì)胞病理學(xué)檢查和(或)胸膜組織病理活檢等相關(guān)輔助檢查確診。其中男35例，女8例，年齡35～81歲，平均(45.8±12.6)歲。本研究通過醫(yī)院倫理審查，各組患者均知情同意并簽署同意書。所有入選對象均排除HIV感染、嚴(yán)重肝腎功能不全、妊娠以及自身免疫性疾病。結(jié)核性胸腔積液臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：臨床表現(xiàn)為有發(fā)熱、盜汗、胸痛、乏力、氣短等癥狀，胸部CT顯示肺內(nèi)無惡性腫瘤相關(guān)表現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物無明顯異常，胸水ADA>45 U/L，胸水細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，排除其他原因引起的胸腔積液，3次胸水病理細(xì)胞學(xué)送檢均未找到腫瘤細(xì)胞，抗結(jié)核治療有效。結(jié)核性胸腔積液確診診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：①胸液涂片或培養(yǎng)查見結(jié)核分枝桿菌；②經(jīng)皮胸膜活檢或胸腔鏡活檢病理確診；符合上述一條以上為符合診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 研究方法

2.1 標(biāo)本采集：兩組患者均在無菌操作下經(jīng)胸腔穿刺術(shù)或胸腔閉式引流術(shù)收集胸水并立即送檢IGRA、胸水腺苷脫氨酶(ADA)以及胸水結(jié)核菌核糖核酸(TB-RNA)。

2.2 檢測方法：IGRA檢測：收集胸水約15～20 ml置入肝素鋰試管，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測IFN-γ，具體操作流程參考外周血IGRA，計算γ-干擾素水平，以INF-γ>60 pg/ml為陽性。胸水ADA采用連續(xù)檢測法，收集胸水約10 ml離心后取上清液3 ml，檢測設(shè)備為全自動生化分析儀，采用酶速率法進(jìn)行檢測，以胸水ADA>45 U/L定義為陽性。TB-RNA檢測：取胸水標(biāo)本8～10 ml，加入1～2倍體積的4%的NaOH于無菌樣品管中渦旋震蕩1 min以充分勻化。取液化好的胸水標(biāo)本3～5 ml于樣品收集管中，13000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 ml生理鹽水重懸洗滌，13000 r/min離心5 min，棄上清，加入50 μl TB稀釋液重懸，該樣本即為待測樣本。將50 μl待測樣本及50 μl已制備好的陽性對照與陰性對照超聲處理15 min，取2 μl 處理物加入到含30 μl 擴增檢測液的潔凈微量反應(yīng)管中。將微量反應(yīng)管置干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min，取出反應(yīng)管置于恒溫混勻儀上42 ℃保溫5 min，同時將實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)(SAT)酶液42 ℃預(yù)熱10 min，保持微量反應(yīng)管于恒溫混勻儀上，向微量反應(yīng)管加入10 μl已預(yù)熱的酶液，立即蓋上管蓋或貼膜振蕩15 s混勻，將微量反應(yīng)管轉(zhuǎn)至熒光檢測器，立即啟動反應(yīng)程序進(jìn)行檢測。IGRA所用檢測試劑均為北京萬泰生物公司提供，TB-RNA檢測試劑盒由上海仁度生物科技有限公司提供，操作均按照相關(guān)說明書進(jìn)行實施。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，計算胸水IGRA、胸水ADA以及胸水TB-RNA檢測的敏感度、特異度、一致性及IGRA+ADA、ADA+TB-RNA、TB-RNA+IGRA和IGRA+ADA+TB-RNA敏感度、特異度、一致性等。三種檢測方法的一致性采用一致性檢驗，用Kappa(K)值表示，K值>0.75認(rèn)為一致性好，0.4

結(jié) 果

1 不同檢測方法的陽性率比較 60例診斷為TPE的患者胸水IGRA陽性率為76.67%(46/60)，胸水ADA陽性率為85.0%(51/60)，胸水TB-RNA陽性率為81.67%(49/60)，三者同時陽性者的陽性率為63.33%(38/60)；43例診斷為非TPE患者中，胸水IGRA陽性率為9.30%(4/43)，胸水ADA陽性率為11.63%(5/43)，胸水TB-RNA陽性率為6.98%(3/43)，三者同時陽性者0例。

2 三種檢測方法診斷價值比較 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，胸水IGRA、ADA和TB-RNA在TPE診斷中的靈敏度分別為76.7%、85.0%、81.7%；特異度分別為90.7%、88.4%、90.7%，約登指數(shù)分別為0.674、0.734、0.724。就靈敏度而言，三種檢測方法中，ADA靈敏度最高(85.0%)，IGRA最低(76.7%)；從特異度而言，IGRA(90.7%)與TB-RNA(90.7%)均高于ADA(88.4%)，ADA約登指數(shù)為(0.734)，TB-RNA次之(0.724)，IGRA最低(0.674)。各檢測方法與臨床診斷結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表1。

表1 三種檢測方法診斷價值比較

3 三種檢測方法聯(lián)合對TPE診斷價值比較 采用兩種及兩種以上檢測方法聯(lián)合進(jìn)行診斷，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，IGRA+ADA、ADA+TB-RNA、TB-RNA+IGRA和IGRA+ADA+TB-RNA靈敏度分別為91.7%、95.0%、90.0%、96.7%；特異度分別為81.4%、79.1%、83.7%、74.4%，約登指數(shù)分別為0.731、0.741、0.737、0.711。其中IGRA+ADA+TB-RNA靈敏度最高(96.7%)，TB-RNA+IGRA靈敏度最低(90.0%)，TB-RNA+IGRA特異度最高(83.7%)，IGRA+ADA+TB-RNA特異度最低(74.4%)，ADA+TB-RNA約登指數(shù)最高(0.741)，IGRA+ADA+TB-RNA約登指數(shù)最低(0.711)。IGRA、ADA、TB-RNA三種方法的聯(lián)合檢測與臨床診斷結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

表2 三種檢測方法聯(lián)合對TPE診斷價值比較

討 論

TPE是由于結(jié)核桿菌及其自溶、代謝產(chǎn)物進(jìn)入超敏感機體胸膜腔，導(dǎo)致胸膜產(chǎn)生高度變態(tài)反應(yīng)而發(fā)生的胸膜炎癥[5]。由于胸膜腔的無菌性特征，故胸水涂片和胸水結(jié)核菌培養(yǎng)陽性率均偏低，而胸腔鏡下胸膜活檢盡管陽性率高，但存在技術(shù)操作較復(fù)雜、價格昂貴以及為有創(chuàng)等缺點，難以在廣大中小型醫(yī)院開展，故長期以來TPE的診斷主要靠多種檢查手段綜合分析判定。IGRA檢測原理是在結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染患者外周血或感染部位體液中會產(chǎn)生記憶T淋巴細(xì)胞并長期在人體內(nèi)存在，當(dāng)再次受到MTB相關(guān)抗原刺激后會迅速增殖成為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞并分泌γ-干擾素[4-5]，通過測定T細(xì)胞γ-干擾素釋放反應(yīng)可用來檢查患者是否受到MTB感染[6]。目前在應(yīng)用外周血或胸水作為IGRA標(biāo)本選擇上尚存在一定爭議，多數(shù)學(xué)者傾向于采用外周血IGRA診斷TPE，且獲得了較高的診斷敏感度和特異度。Ates等[7]研究發(fā)現(xiàn)采用胸水IGRA診斷TPE準(zhǔn)確性較差，但Liu等[8]發(fā)現(xiàn)采用胸水或者外周血IGRA診斷TPE，二者靈敏度均可達(dá)到90%以上，與劉慧梅等[9]研究結(jié)果一致。而周敏等[10]研究結(jié)果表明，與外周血IGRA比較，胸腔積液IGRA可能對TPE診斷價值更高。劉亞亞等[4]研究顯示胸水IGRA單獨診斷TPE時其靈敏度、特異度分別為96.38%、29.31%，而聯(lián)合ADA診斷TPE時其靈敏度、特異度分別為81.88%、98.28%。本研究結(jié)果顯示胸水IGRA診斷TPE靈敏度、特異度分別為76.67%、90.70%，與上述研究結(jié)果存在一定差異，考慮與所選樣本量較小有關(guān)。本研究結(jié)果顯示采用聯(lián)合檢測后靈敏度較單項檢測均有明顯提高，IGRA+ADA+TB-RNA三者聯(lián)合時靈敏度最高為96.7%，更有利于TPE診斷。胸腔積液γ-干擾素水平增高有助于TPE的診斷，研究顯示胸腔積液γ-干擾素水平>3.7 U/ml TPE的診斷敏感性和特異性均可達(dá)到98%以上，明顯高于胸腔積液結(jié)核菌涂片和培養(yǎng)陽性率，但膿胸患者胸腔積液γ-干擾素水平亦可增高[1]，故需要在臨床上進(jìn)一步鑒別。

ADA是T淋巴細(xì)胞的一種重要的酶，其廣泛存在于全身組織中，其功能為催化腺苷脫氨生成肌酐，與細(xì)胞免疫活性有關(guān)。ADA活性增高與T淋巴細(xì)胞的激活、增值、分化有關(guān)。TPE患者因細(xì)胞免疫受刺激，淋巴細(xì)胞明顯增多，故ADA在TPE中的含量較惡性胸腔積液及右心功能不全引起的胸腔積液均顯著增高，表明胸腔積液ADA測定對上述胸腔積液的鑒別有重要意義[11]。既往關(guān)于ADA診斷TPE薈萃分析顯示：ADA在TPE診斷中具有較高的價值，也可作為TPE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。目前國內(nèi)多以ADA(>45 U/L)作為診斷TPE的臨界值，胸腔積液ADA/血清ADA>1也是目前診斷TPE的常用指標(biāo)之一。大量研究顯示ADA在TPE的診斷上具有較高的準(zhǔn)確度、敏感度和特異度，但檢測結(jié)果也存在假陰性或假陽性的問題，文獻(xiàn)報道ADA有時存在診斷的敏感度和特異度偏低的情況，敏感度低多考慮與機體免疫功能減退(如感染人免疫缺陷病毒)或炎癥早期有關(guān)[13]。但值得注意的是：胸腔積液ADA水平升高也可出現(xiàn)在肺炎旁胸腔積液、類風(fēng)濕性疾病所致胸腔積液、肺吸蟲病以及大多數(shù)膿胸患者中，此外在一些較為罕見的疾病如Q熱和布魯斯桿菌病患者中亦可表現(xiàn)為增高[14]，故在上述疾病中特異度較低。本研究結(jié)果表明ADA在TPE診斷中具有較高的特異度(88.37%)。大量研究表明以>45 U/L為界，其診斷TPE總的準(zhǔn)確度可達(dá)到99.2%、敏感度為100%、特異度為98.6%[11]，與本研究結(jié)果存在一定偏差，考慮與所選樣本量較小有關(guān)。此外，研究表明胸腔積液ADA數(shù)值與TPE診斷呈正相關(guān)，即胸腔積液ADA水平越高，患TPE可能性越大[15-16]。

實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)(SAT)是基于PCR發(fā)展起來的一種核酸序列擴增的新技術(shù)，以病原體RNA為檢測模板，具有高度的敏感性和特異性[11]，無需溫度循環(huán)，反應(yīng)速度快，擴增效率高。另外因SAT不需要經(jīng)過高溫變性步驟，即使在有背景DNA的存在亦不會受到影響，故其檢測敏感性和準(zhǔn)確性均明顯高于其他分子檢測技術(shù)。Cui等[17]采用SAT技術(shù)檢測MTB，靈敏度可達(dá)到100 CFU/ml，在菌陰患者標(biāo)本中陽性率39.2%，結(jié)果與臨床診斷一致。林忠惠等[18]研究發(fā)現(xiàn)胸水TB-RNA在TPE診斷上具有較高的靈敏度和特異度，與本研究結(jié)果基本一致。因RNA只存在于活的結(jié)核分枝桿菌內(nèi)，故TB-RNA檢測技術(shù)亦可用于活動性肺結(jié)核的診斷和治療效果的監(jiān)測，尤其對菌陰肺結(jié)核具有更高的臨床診斷價值[19-20]。此外SAT技術(shù)可輔助判斷抗結(jié)核治療的效果，羅賢等[21]采用SAT技術(shù)快速檢測治療前后痰標(biāo)本中的MTB，發(fā)現(xiàn)其對痰中結(jié)核桿菌具有較高的靈敏度，可用于肺結(jié)核早期診斷和治療療效的判斷，并可為治療方案的早期調(diào)整提供參考。但目前在應(yīng)用基因檢測技術(shù)診斷肺外結(jié)核病時尚存在標(biāo)本處理不當(dāng)、操作方法不規(guī)范、技術(shù)不過關(guān)、擴增系統(tǒng)操作較復(fù)雜等技術(shù)方面問題，存在假陽性，進(jìn)而間接造成檢測結(jié)果出現(xiàn)誤差[22]。

崔魁麗等[23]研究發(fā)現(xiàn)，TPE特別是合并有明顯胸腔積液的患者，其體內(nèi)γ-干擾素、ADA表達(dá)水平明顯高于非結(jié)核組。本研究結(jié)果顯示聯(lián)合應(yīng)用上述三種檢測技術(shù)，可以進(jìn)一步提高臨床診斷TPE的靈敏度，降低漏診率，值得推廣使用。