肺癌癌組織中過(guò)氧化物酶增殖體激活受體γ基因表達(dá)水平對(duì)培美曲塞化療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值*

楊 昕，劉 芳，杜 靜，張繼朋

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科(咸陽(yáng) 712000)；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科(西安 710038)

隨著空氣污染問(wèn)題的不斷惡化，肺癌作為目前發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率依然不斷上升[1]，非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的類(lèi)型，還可以進(jìn)一步分為腺癌、鱗癌及大細(xì)胞癌[2]，早期NSCLC選擇手術(shù)治療可以極大的提高生存時(shí)間，但超過(guò)75%的患者確診時(shí)已是中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)，這也是目前NSCLC 5年生存率不超過(guò)20%的重要原因[3]。培美曲塞是經(jīng)美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療NSCLC的抗葉酸代謝抗腫瘤藥物，對(duì)于NSCLC有著很好的療效且毒性較低，對(duì)其他腫瘤也有不錯(cuò)的療效[4]。過(guò)氧化物酶增殖體激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是由配體激活的一類(lèi)重要轉(zhuǎn)錄因子，有3種亞型，其中PPARγ位于多種信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的交叉點(diǎn)位置，在機(jī)體的多種生理及病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]，并且有報(bào)道其與腫瘤進(jìn)程的關(guān)系密切[6]。目前PPARγ表達(dá)水平與培美曲塞治療NSCLC療效之間關(guān)系報(bào)道較少，本次研究利用qRT-PCR檢測(cè)了化療前PPARγ的表達(dá)水平，并分析了PPARγ表達(dá)水平與培美曲塞化療療效及遠(yuǎn)期預(yù)后之間的關(guān)系。

資料與方法

1 一般資料 選取我院2014年1月至2017年1月診治的經(jīng)組織病理學(xué)驗(yàn)證為晚期NSCLC患者80例為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷為NSCLC，且影像學(xué)資料提供可測(cè)病灶，根據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)TNM分期[7]證實(shí)為Ⅲ期及Ⅳ期；②首次化療，未進(jìn)行過(guò)手術(shù)、放療及分子靶向治療；③適合且能夠耐受培美曲塞聯(lián)合順鉑治療；④化療期間為同步或序貫接受放療及其他抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②預(yù)計(jì)生存期<3個(gè)月；③嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；④合并血常規(guī)及心電圖結(jié)果異常；⑤無(wú)法配合完成治療及復(fù)查者。80例入組患者中男44例，女36例，年齡40～72歲，中位年齡57歲，TNM分級(jí)Ⅲ b期21例，Ⅳ期59例。

2 研究方法

2.1 化療方法：所有患者的治療用量均根據(jù)體表面積計(jì)算。首日給予培美曲塞500 mg/m2，順鉑75 mg/m2，靜脈滴注。并于化療前1周開(kāi)始口服葉酸400 μg/d，持續(xù)時(shí)間超過(guò)5 d，一直持續(xù)到末次給予培美曲塞后21 d，化療前1 d至給藥后1 d，3 d連續(xù)給予地塞米松4 mg口服，2次/d，并在化療前1周于肌肉主色維生素B121000 μg，每3周期重復(fù)一次。每化療2個(gè)周期評(píng)價(jià)一次。

2.2 PPARγ表達(dá)檢測(cè)方法：按照試劑盒中說(shuō)明書(shū)操作步驟提取瘤組織及對(duì)應(yīng)正常組織的總RNA，提取后用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)，OD值(A260/A280)=1.8～2.1，并用凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；按照試劑盒種說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系(10 μl)：2×miRNA反應(yīng)混合液5 μl，0.1% BSA 1 μl，miRNA PrimeScript RT酶混合物1 μl，總RNA0.5 μl，去RNA酶ddH2O 2.5 μl。反應(yīng)條件設(shè)置：37℃ 60 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min。PCR體系10 μl：SYBR Prmix Ex Tap II(2×)5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX Reference Dye II(50×)0.2 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 3 μl。詳細(xì)操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。內(nèi)參基因采用β-actin，PPARγ擴(kuò)增引物：上游引物5’-TGGAATTAGATGACAGCGACTTGG-3’，下游引物5’-AGGACTCAGGGTGGTTCAGC-3’。每個(gè)樣孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均Ct值進(jìn)行分析，以2-△△Ct作為相對(duì)表達(dá)量。

3 化療效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 每化療2個(gè)周期進(jìn)行1次影像學(xué)復(fù)查，療效評(píng)價(jià)參照RECIST標(biāo)準(zhǔn)判定。完全緩解：影像學(xué)可見(jiàn)腫瘤完全消失；部分緩解：可測(cè)量病灶體積縮小超過(guò)30%；穩(wěn)定：介于部分緩解和進(jìn)展之間；進(jìn)展：可測(cè)量病灶體積增大超過(guò)20%或有新的病灶出現(xiàn)?？陀^有效率(ORR)=完全緩解率+部分緩解率，疾病控制率(DCR)=完全緩解率+部分緩解率+穩(wěn)定率。

4 隨 訪 患者自病理確診之日起開(kāi)始門(mén)診復(fù)查或電話隨訪，治療后1年內(nèi)每3個(gè)月門(mén)診復(fù)查1次，2年內(nèi)半年復(fù)查1次，以后至少每年復(fù)查一次，隨訪截止2019年1月，最少隨訪24個(gè)月，以患者死亡為研究重點(diǎn)。隨訪記生存時(shí)間及隨訪時(shí)狀態(tài)(存活、死亡或其他)等。

結(jié) 果

1 化療前癌組織中及癌旁組織中PPARγ表達(dá)水平 癌組織中PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 化療前肺癌組織中及癌旁組織中PPARγ表達(dá)水平

2 化療療效及病情控制與病情進(jìn)展患者癌組織中PPARγ表達(dá)水平 根據(jù)治療過(guò)程中影像學(xué)檢查結(jié)果，完全緩解0例(0.00%)，部分緩解26例(32.50%)，穩(wěn)定35例(43.75%)，進(jìn)展19例(23.75%)，ORR為32.50%(26/80)，DCR為76.25%(61/80)；疾病控制組PPARγ mRNA表達(dá)水平高于病情進(jìn)展組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 病情控制組和病情進(jìn)展組中PPARγ表達(dá)水平

3 PPARγ表達(dá)水平對(duì)培美曲塞化療療效預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC分析 ROC分析結(jié)果顯示，PPARγ表達(dá)水平預(yù)測(cè)培美曲塞化療有效的AUC=0.779，95%CI：0.673～0.885，Cutoff值為2.855(圖1)。

圖1 PPARγ表達(dá)水平對(duì)培美曲塞化療療效預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線

4 PPARγ表達(dá)水平與PFS間的關(guān)系 以ROC的cutoff值將所有患者分為PPARγ高表達(dá)組及PPARγ低表達(dá)組，PPARγ高表達(dá)組有51例，PPARγ低表達(dá)組有29例。80例NSCLC患者2年內(nèi)死亡42例，存活率為47.50%，Kaplan-Meier曲線結(jié)果顯示PPARγ高表達(dá)組的2年總生存率58.82%(30/51)顯著高于PPARγ低表達(dá)組的27.59%(8/29)。見(jiàn)圖2。

圖2 PPARγ表達(dá)水平與2年生存率的關(guān)系

討 論

培美曲塞作為一種抗葉酸代謝類(lèi)抗腫瘤藥物，能夠抑制葉酸代謝過(guò)程中的3種關(guān)鍵酶活性，葉酸是人體必需的一類(lèi)水溶性B族維生素，參與人體胸腺嘧啶及嘌呤的合成，培美曲塞主要就是通過(guò)抑制葉酸的合成，導(dǎo)致DNA和RNA的合成受阻，最終發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[8]。正是由于培美曲塞的多靶點(diǎn)性，其在臨床抗腫瘤的運(yùn)用上有不錯(cuò)的效果，尤其是對(duì)肺腺癌具有顯著的抑制作用[9]，同時(shí)在用于非鱗NSCLC一線及二線治療的效果也要優(yōu)于多西他賽、吉西他濱等常用化療藥物[10]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)肺癌晚期患者進(jìn)行培美曲塞聯(lián)合順鉑化療治療發(fā)現(xiàn)，其ORR為32.50%，DCR為76.25%，表明培美曲塞聯(lián)合順鉑化療的效果良好，能夠很好的控制住患者病情的進(jìn)展。陳紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)培美曲塞聯(lián)合順鉑治療復(fù)發(fā)性肺腺癌患者的ORR為57.50%和87.50%，與本研究結(jié)果較為接近。

PPARγ是Ⅱ型核激素受體超家族中的一員，作為一種配體依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄因子，在人體脂肪組織、乳腺、結(jié)腸、肺、卵巢、胎盤(pán)等中高表達(dá)，其在促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[12]。正是由于PPARγ的促分化效應(yīng)，故而其被激活后還有抗細(xì)胞增殖功能，目前人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的PPARγ配體主要是前列腺素，大量研究[13]表明，PPARγ配體可以通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲等過(guò)程來(lái)調(diào)控腫瘤的進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，PPARγ在肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，這與李虹等[14]研究相一致，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，化療前PPARγ水平越低，其化療效果可能越差。可能是因?yàn)镻PARγ具有調(diào)控癌細(xì)胞培美曲塞敏感性作用，高表達(dá)的PPARγ增加了肺癌細(xì)胞的培美曲塞敏感性，因此表達(dá)量越高培美曲塞化療效果越好。李強(qiáng)等[15]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中PPARγ的mRNA表達(dá)量顯著高于正常組織，同時(shí)高表達(dá)PPARγ患者的預(yù)后要優(yōu)于表達(dá)患者，與本研究結(jié)果相符。

我們利用ROC曲線評(píng)估了PPARγ表達(dá)水平對(duì)培美曲塞化療療效預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)PPARγ表達(dá)水平預(yù)測(cè)培美曲塞化療療效的AUC達(dá)到了0.779，表明PPARγ表達(dá)水平具有不錯(cuò)的預(yù)測(cè)培美曲塞化療療效的效果價(jià)值。根據(jù)Cutoff值將患者分為PPARγ高表達(dá)組和PPARγ低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，PPARγ高表達(dá)組的2年內(nèi)無(wú)病生存率高于PPARγ低表達(dá)組，提示PPARγ表達(dá)水平還具有遠(yuǎn)期預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，由于肺癌患者多半發(fā)現(xiàn)已是晚期，故而治療多以延長(zhǎng)患者的生存期及生活質(zhì)量為主，在化療的過(guò)程中對(duì)其療效預(yù)測(cè)及及時(shí)的區(qū)分化療不敏感患者具有重要的臨床意義，PPARγ作為一種抑癌基因，其表達(dá)水平具有很好的臨床指導(dǎo)意義，PPARγ高表達(dá)患者的化療效果及2年內(nèi)生存率均要優(yōu)于PPARγ低表達(dá)患者，同時(shí)也表明PPARγ可以作為一種定向治療的靶點(diǎn)。但由于本研究樣本較小，因此還需要進(jìn)行大樣本前瞻性隨機(jī)研究，進(jìn)一步明確PPARγ表達(dá)水平的預(yù)測(cè)價(jià)值。