響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取菜籽蛋白工藝參數(shù)的研究

李逸鶴 程婷婷

摘要：菜籽蛋白是一種非常具有開發(fā)價(jià)值的植物蛋白，而利用超聲輔助提取可以有效提高菜籽蛋白的提取率。本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助進(jìn)行菜籽蛋白提取的工藝參數(shù)，結(jié)果表明：超聲頻率28kHz、超聲時(shí)間40.1min、超聲溫度51℃、超聲強(qiáng)度為44W/L時(shí)，菜籽蛋白的提取率為91.35%，在此條件下提取效果最好。

關(guān)鍵詞：超聲處理;菜籽蛋白;提取工藝;菜籽粕

中圖分類號(hào)：TS225.14

作者姓名：李逸鶴，男，碩士，講師，研究方向?yàn)楣任?、食品加工教學(xué)。

菜籽粕中富含菜籽蛋白[1]，而菜籽蛋白是一種全價(jià)蛋白，沒(méi)有限制氨基酸，并且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理活性[2-3]。菜籽蛋白消化率在95%～100%，其蛋白效價(jià)比大豆蛋白還高，也高于酪蛋白[4]。因此，通過(guò)對(duì)菜籽蛋白的提取和開發(fā)，使之成為新型優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，擴(kuò)大其在食品加工領(lǐng)域地應(yīng)用，具有良好的市場(chǎng)前景。

目前，堿提酸沉法是菜籽蛋白目前科研和實(shí)際生產(chǎn)最常用的提取方法，但其缺點(diǎn)為蛋白質(zhì)得率相對(duì)低[5]。超聲輔助提取技術(shù)被認(rèn)為是一種有效的提取技術(shù)，可以顯著縮短工作時(shí)間，提高產(chǎn)量和質(zhì)量[6]。超聲效應(yīng)主要包括熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)三種。其中空化效應(yīng)是超聲波與液體介質(zhì)相互作用的主要超聲效應(yīng)[7]。通過(guò)空化效應(yīng)可以破壞植物的細(xì)胞壁，使蛋白能夠更容易浸出，從而提高菜籽蛋白的提取率。因此，本文通過(guò)對(duì)超聲輔助提取菜籽蛋白的工藝進(jìn)行研究，以得到最佳的工藝參數(shù)，為菜籽蛋白的開發(fā)利用提供有效的幫助。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試劑與材料

菜籽粕：中糧張家港東海糧油有限公司;濃硫酸、乙醚、乙醇、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、鹽酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

超聲設(shè)備：江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院制造;DD-5M低速離心機(jī)：湖南湘儀試驗(yàn)室儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市雙捷試驗(yàn)儀器廠;PHS-2C型數(shù)顯pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司;紫外分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)步驟

（1）菜籽蛋白的提取工藝。菜籽粕去除雜質(zhì)，研磨過(guò)60目篩，用石油醚浸泡2次（1h/次），干燥后放置于4℃冰箱中待用。試驗(yàn)時(shí)，以液料比15∶1將10g菜籽粕分散到蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為12，在提取溫度50℃條件下浸提1h，浸提期間每間隔15min測(cè)一次pH，并用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)至初始pH，然后用離心機(jī)以4 000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，收集上清液;再利用上述方法進(jìn)行重復(fù)提取固體殘?jiān)?。最后將兩次提取的上清液混合，用Folin-酚試劑法（Lowry法）[8]測(cè)定上清液中的蛋白含量，用凱氏定氮法測(cè)定菜籽粕中蛋白含量，計(jì)算菜籽蛋白提取率。計(jì)算公式如下：

蛋白提取率（%）=提取液中蛋白含量÷樣品中蛋白含量×100? （1）

（2）超聲處理。將pH值調(diào)整后的菜籽粕溶液放入超聲池中，調(diào)節(jié)超聲參數(shù)，進(jìn)行超聲處理。其中超聲頻率：20kHz、28kHz、35kHz、40kHz、50kHz和60kHz;超聲功率：10W/L、20W/L、30W/L、40W/L和50W/L;超聲時(shí)間10min、20min、30min、40min和50min;超聲溫度：35℃、40℃、45℃、50℃和55℃;超聲工作時(shí)間3s，超聲間歇時(shí)間2s。之后，按照上述菜籽蛋白提取工藝對(duì)處理后的菜籽粕溶液展開試驗(yàn)，并計(jì)算菜籽蛋白的提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲參數(shù)單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲頻率對(duì)菜籽蛋白提取率的影響

如圖1所示，通過(guò)超聲處理后，菜籽蛋白的提取率都有所提高。這是因?yàn)槌曂ㄟ^(guò)空化效應(yīng)使菜籽粕的細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞從而使蛋白能夠更好地溶出。其中在超聲頻率為28kHz時(shí)，菜籽蛋白的提取率最高。這是因?yàn)槌暡l率越高，其空化作用強(qiáng)度越低，從而使超聲的空化效應(yīng)降低，所以當(dāng)其他超聲參數(shù)不變時(shí)，超聲頻率越高，空化效果越低。同時(shí)，由于不同的物質(zhì)對(duì)超聲波的敏感程度不同，發(fā)生共振的頻率不同，從而造成頻率方面的差異。因此，最終以超聲頻率28kHz進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)菜籽蛋白提取率的影響

如圖2所示，隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)，菜籽蛋白的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在40min時(shí)，菜籽蛋白的提取率最大。這說(shuō)明在超聲的空化效應(yīng)作用下，菜籽粕的細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，使蛋白在提取過(guò)程中更容易溶出。當(dāng)作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能使得部分菜籽蛋白產(chǎn)生變性，降低蛋白的溶出效果，從而導(dǎo)致菜籽蛋白的提取率下降。因此，選定最佳超聲時(shí)間為40min。

2.1.3 超聲溫度對(duì)菜籽蛋白提取率的影響

如圖3所示，超聲溫度升高，菜籽蛋白的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在50℃時(shí)，提取效果最佳。當(dāng)溫度升高，有利于菜籽蛋白從菜籽粕細(xì)胞結(jié)構(gòu)中溶出，同時(shí)提高菜籽蛋白的溶解度，從而使提取率增加。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，容易導(dǎo)致菜籽蛋白變性，使蛋白的溶解性下降從而降低菜籽蛋白的提取率。因此，最終確定最佳超聲溫度為50℃。

2.1.4 超聲強(qiáng)度對(duì)菜籽蛋白提取率的影響

超聲強(qiáng)度對(duì)菜籽蛋白提取率的影響如圖4所示。隨著超聲強(qiáng)度提高，菜籽蛋白的提取率逐漸增加，這說(shuō)明隨著超聲強(qiáng)度的增加，菜籽蛋白更容易從菜籽粕中溶出，從而提高了菜籽蛋白的提取率。但是當(dāng)超聲強(qiáng)度超過(guò)30W/L后，增加的速度變的平緩。因此，從試驗(yàn)結(jié)果及能量消耗方面考慮，最終確定最佳的超聲強(qiáng)度為40W/L。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度三個(gè)因素進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)，以菜籽蛋白的提取率為響應(yīng)值。響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)的因素水平如表4所示。利用Design Export軟件Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果如表5所示。

通過(guò)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，建立回歸模型。其二次回歸方程為：

Y=91.11+0.27×A+0.67×B+0.95×C-0.34×AB-0.35×AC+0.72×BC-2.65×A2-2.24×B2-1.38×C2? （2）

如表6所示，根據(jù)分析結(jié)果可以看出該模型P值<0.000 1，說(shuō)明數(shù)學(xué)模型非常顯著。模型相關(guān)系數(shù)的置信度為0.990 2，失擬誤差不顯著（P=0.066 8>0.05）說(shuō)明本模型的擬合程度好，試驗(yàn)誤差小，可以用于對(duì)蛋白提取率的預(yù)測(cè)。能解釋約99.02%的響應(yīng)值與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合性良好。B、C、BC、A2、B2、C2是模型的的顯著因素，且單因素的影響大小排序?yàn)镃>B>A。各交互項(xiàng)影響大小的排序?yàn)锽C>AC>AB。根據(jù)軟件的分析結(jié)果得到預(yù)測(cè)的最佳蛋白提取條件為：超聲時(shí)間40.1min，超聲溫度51℃，超聲強(qiáng)度44W/L，在此條件下菜籽蛋白的提取率為91.37%。

2.3 響應(yīng)面最優(yōu)條件驗(yàn)證結(jié)果

由于優(yōu)化出來(lái)的最優(yōu)組合未在17組試驗(yàn)中出現(xiàn)，所以需要通過(guò)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其有效性和穩(wěn)定性。采取最佳超聲條件進(jìn)行預(yù)處理，然后得到提取率為91.35%，與預(yù)測(cè)值接近。

3 結(jié)論

本文采用了超聲輔助菜籽粕提取菜籽蛋白的工藝參數(shù)研究。通過(guò)超聲的空化效應(yīng)加速菜籽蛋白的溶出，從而提高菜籽蛋白的提取率。在對(duì)超聲頻率、超聲時(shí)間、超聲強(qiáng)度和超聲溫度四個(gè)單因素進(jìn)行試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菜籽蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken設(shè)計(jì)影響提取率的超聲強(qiáng)度、超聲時(shí)間和超聲溫度三個(gè)主要因素進(jìn)行了優(yōu)化。利用軟件分析得出了回歸模型：Y=91.11+0.27×A+0.67×B+0.95×C-0.34×AB-0.35×AC+0.72×BC-2.65×A2-2.24×B2-1.38×C2。其中超聲強(qiáng)度和超聲溫度及兩者之間的交互作用是模型的顯著因素，并且優(yōu)化了工藝參數(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]汪蘭，陳冉，杜欣，等.菜籽蛋白氨基酸組成分析及與功能特性的相關(guān)性研究[J].中國(guó)油脂，2012，37（2）：1-7

[2]Manashi D， Anuj K， Sougata S， et al. Effect of maleylation on physicochemical and functional properties of rapeseed protein isolate[J] Journal of Food Science And Technology，2016（53）：1784-1797

[3]金晶，徐志宏.超聲微波輔助法提純菜籽蛋白的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（3）：275-278.

[4]席鵬彬，李德發(fā).中國(guó)不同品種菜粕豬回腸氨基酸消化率研究[J].中國(guó)畜牧雜志，2002，38（4）：5-7

[5]鄒強(qiáng)，王燕.菜籽蛋白提取分離及其功能特性的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2010，16（7）：62-65

[6]馬海樂(lè)，張連波.米糠蛋白的脈沖超聲輔助提取技術(shù)[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，27（1）：14-17.

[7] Yolanda PicoUltrasound-assisted extraction for food and environmental samples [J].Trends in Analytical Chemistry，2013，43：84-99.

[8]Lowry O， Rosebrough N， Farr A， et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry，1951，193（1）：265-275.