玫瑰紅景天粗脂肪的成分及其性質分析

田光輝 龐海霞 劉存芳 劉軍海 吳睿 張強 王偉

摘要：以乙醚為溶劑，利用索氏提取器提取玫瑰紅景天的粗脂肪并用氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，簡稱GC-MS）分析其組分;測定玫瑰紅景天粗脂肪的抗菌活性及其對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH）自由基、羥自由基的清除率，以確定其抗氧化活性。結果表明，玫瑰紅景天粗脂肪的主要組分為乙酸二十三醇酯（31.71%）、乙酸二十七醇酯（20.55%）、乙酸二十一醇酯（17.89%）、香葉醇（3.96%）、1-辛醇（2.87%）、1-二十一醇（2.75%）、亞麻酸（2.58%）等;玫瑰紅景天粗脂肪對抗菌試驗菌株均有抑制和滅活作用，其中對白色念珠菌ATCC 10231株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，簡稱MIC）為0.08 mg/mL，最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，簡稱MBC）為0.72 mg/mL，對金黃色葡萄球菌ATTCC 25925株的MIC為0.16 mg/mL，MBC為2.18 mg/mL;對DPPH自由基和羥自由基均有清除作用，對DPPH自由基、羥自由基的半抑制濃度（IC50）分別為0.005 7、0.010 2 mg/mL。由研究結果可以看出，玫瑰紅景天粗脂肪有潛在的應用價值。

關鍵詞：玫瑰紅景天;粗脂肪;氣相色譜-質譜法;抗菌活性;抗氧化活性

中圖分類號： R284. 1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0205-06

收稿日期：2019-09-16

基金項目：陜西省科技廳社會發(fā)展科技攻關項目（編號：2018SF-307）;陜西省教育廳重點實驗室項目（編號：19JS011）。

作者簡介：田光輝（1970—），男，陜西渭南人，碩士，教授，從事天然產物開發(fā)與利用研究。E-mail：tiangh@snut.edu.cn。

通信作者：劉存芳，碩士，教授，從事藥用活性分子篩選研究。Tel：（0916）2641670;E-mail：liucf@snut.edu.cn。

玫瑰紅景天（Rhodiola rosea L.）又名為薔薇紅景天[1]，為景天科紅景天屬一種多年生草本植物，在我國西藏、寧夏、甘肅等地及朝鮮、保加利亞、芬蘭等國家有分布[2-3]，是被廣泛使用的中藥材。玫瑰紅景天有玫瑰香味，全草藥食兩用，中藥常用其根莖，其性味“甘、苦、平。歸肺、心經”，其氣香甜、味苦澀，能“扶正固本”?！渡褶r本草經》中將紅景天列為藥中上品，并指出：服用紅景天可輕身益氣，不老延年，無毒多服。玫瑰紅景天有抗病毒、抗抑郁、抗缺氧、抗疲勞、抗輻射、抗腫瘤、活血化瘀等生物活性[4-5]，常用于治療氣虛血瘀、胸痹心痛、中風偏癱、倦怠氣喘、冠心病等病癥，同時具有保護心腦血管的功能[6]，還能益氣活血、通脈平喘。這些生物活性與玫瑰紅景天中的成分密切相關，其主要成分為紅景天苷（ralidroside）[7]及其苷元酪醇（ptyrosol）、酪薩維（rosavin）、絡塞（rosin）、絡塞琳（rosarin）、草質素苷（rhodiolin）、紅景天素（rhodiosin）等[8-9]。此外，有研究者還分離出了沒食子酸、沒食子酸甲酯、山柰酚、6′-O-沒食子酰-紅景天苷、7-甲氧基香豆素等化合物[10-11];還有借助微波法提取玫瑰紅景天總黃酮和多糖[12]、優(yōu)化玫瑰紅景天多糖的提取工藝[13]、開展玫瑰紅景天提取物活性的研究[14-15];另外，有研究者開發(fā)出了玫瑰紅景天功能食品，并將其提取物作為食品補充劑使用，如紅景天口服液、紅景天糖漿、紅景天酒、紅景天飲料等制劑[16]。目前，關于玫瑰紅景天中脂溶性物質的研究尚少[17]，而對景天科同屬植物高山紅景天[18]、大花紅景天[19]、小叢紅景天[20]、狹葉紅景天[21]等脂溶性物質的研究較多[22]。紅景天植物脂溶性物質有諸多特殊活性，如抗菌、抗氧化等作用[20]，值得深入研究。本研究以乙醚為溶劑，用索氏提取法從玫瑰紅景天中提取其粗脂肪，用氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，簡稱GC-MS）進行分離和鑒定，并測試玫瑰紅景天粗脂肪的體外抗菌和抗氧化活性，嘗試分步提取玫瑰紅景天中的活性物質，以期為綜合利用該珍稀野生資源提供依據。

1?材料與方法

1.1?材料、試劑與儀器

玫瑰紅景天采自西藏林芝地區(qū)，經陜西理工大學植物學省級重點學科負責人趙樺教授鑒別確認，去除其根莖的須根和枝葉后，于低溫干燥至恒質量。白色念珠菌ATCC 10231株、金黃色葡萄球菌ATTCC 25925株、腸炎沙門氏菌50040株、大腸桿菌ATCC 25922株、短小芽孢桿菌ATCC 7061株、肺炎鏈球菌ATCC 49619株、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031株、傷寒沙門氏菌CMCC 50071株、鼠傷寒沙門菌50013株等9種標準菌株凍干品，由中國食品藥品檢定研究院中國醫(yī)學細菌保藏管理中心提供。水解酪蛋白胨肉湯（MHB）、普通瓊脂平板培養(yǎng)基、Leagene肉湯（CM）培養(yǎng)基，產自北京索萊寶科技有限公司。本試驗所用其他試劑均為國產分析純級，產自西安化學試劑廠。按如下方法配制濃度為 150 mmol/L、pH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，簡稱PBS）：精確稱取14328 g磷酸氫鈉、6.242 g磷酸二氫鈉于200 mL容量瓶中，分別進行定容，分別移取1620 mL磷酸氫鈉溶液、38.0 mL磷酸二氫鈉溶液于300 mL容量瓶內，定容;臨時配制濃度為 1.5 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液、濃度為1.5 mmol/L的鄰二氮菲乙醇溶液、質量分數為0.02%的雙氧水溶液、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，簡稱DPPH）濃度為0.1 mmol/mL的DPPH乙醇溶液;試驗用水為二次蒸餾水。

Trace DSQ GC-MS（DB-5彈性石英毛細管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm），產自美國熱電公司;96孔培養(yǎng)板，產自美國康寧公司;微生物培養(yǎng)箱，產自西安華辰樂天實驗室設備有限公司;HH-2型電熱恒溫水浴鍋，產自北京科偉永興儀器有限公司;AL-204-IC電子天平，產自北京瑞澤康科技有限公司;中藥材粉碎機，產自天津市泰斯特儀器有限公司;UV-6300PC紫外可見分光光度計，產自上海美譜達儀器有限公司;Soxhlet extractor提取器等玻璃儀器，產自上海洪紀儀器設備有限公司。

1.2?試驗方法

1.2.1?玫瑰紅景天粗脂肪的制取?用粉碎機將玫瑰紅景天根莖粉碎、過50目篩后密封保存。準確稱取25.0 g粉末裝進濾紙筒后放入抽提筒內，注入乙醚浸泡;在蒸餾瓶中加入總體積1/2的乙醚，于 40 ℃ 恒溫水浴中抽提，直至抽提筒內的乙醚用濾紙點滴檢查無油跡為止，需回流18 h;回收乙醚，得到15.5 g深黃色的玫瑰紅景天粗脂肪，提取率為62%。重復提取3次，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?GC-MS測試條件?色譜條件：氦氣作為載氣，色譜柱溫度范圍為40～280 ℃，初始溫度為 40 ℃，保持1 min，按7 ℃/min的速率程序升溫，溫度升至180 ℃后，保持2 min，再按10 ℃/min的速率升溫至250 ℃，保持3 min;色質界面設定260 ℃，衡流模式的流量為1 mL/min。取少許玫瑰紅景天粗脂肪，用乙醚溶解，進樣量為0.5 μL，設置30 ∶1的分流比。質譜條件：離子源為電子轟擊電離（EI），溫度設定為250 ℃，電離能量設定為70 eV，倍增器電壓為980 V，全掃描模式范圍為40～500 amu。將各質譜圖對比NIST譜庫和WILEY譜庫中的入庫譜圖，經計算機檢索，相似度大于85%，初步確定物質結構。用峰面積歸一化法對總離子流圖譜通過計算機確定玫瑰紅景天粗脂肪中各個組分的相對含量。

1.2.3?玫瑰紅景天粗脂肪的抗菌試驗?將9種標準菌株凍干品復蘇后分別接種在MHB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中設置溫度為37 ℃，持續(xù)孵育24 h，用光電比濁計數法測定菌液中的細菌數量，用培養(yǎng)液稀釋細菌群落總數至106 CFU/mL。將玫瑰紅景天粗脂肪溶于含有5% Tween-80的肉湯中，連續(xù)二倍梯度稀釋后，在96孔培養(yǎng)板上以0.15 mL/孔的量注入不同濃度的玫瑰紅景天粗脂肪溶液，分別注入濃度為106 CFU/mL的試驗菌液，注射量為 50 μL/孔，同時設置空白對照（不加玫瑰紅景天粗脂肪溶液），在濕盒內放置水平后再放入微生物培養(yǎng)箱中，在控溫37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h后觀測，沒有細菌生長孔的玫瑰紅景天粗脂肪溶液的最低濃度即為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，簡稱MIC）。將無細菌生長孔中的培養(yǎng)物用無菌生理鹽水稀釋20倍，再分別吸取 0.05 mL 接種于普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，放入微生物培養(yǎng)箱中，在控溫 37 ℃ 的條件下培養(yǎng)24 h，沒有細菌生長接種區(qū)域對應的最小玫瑰紅景天粗脂肪溶液濃度即為最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，簡稱MBC）[23]。

1.2.4?玫瑰紅景天粗脂肪對DPPH·清除率的測定?稱取適量玫瑰紅景天粗脂肪，用乙醇溶解后分別定容至6個10 mL容量瓶中，分別得到質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的玫瑰紅景天粗脂肪的乙醇溶液;同時，稱取適量維生素C并用乙醇溶解，在另外6個10 mL容量瓶中定容，分別得到質量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、006 mg/mL的維生素C的乙醇溶液。分別移取 1 mL 不同濃度的玫瑰紅景天粗脂肪乙醇溶液于6個10 mL具塞比色管內，再逐管加入2 mL DPPH溶液，用乙醇定容至10 mL后混勻，在室溫、暗室內靜放35 min;以無水乙醇替代玫瑰紅景天粗脂肪乙醇溶液作為空白對照，以無水乙醇取代DPPH溶液作為對照，在517 nm波長處測定吸光度D517nm。同時，以維生素C作為參照代替玫瑰紅景天粗脂肪乙醇溶液進行測定。按下式計算玫瑰紅景天粗脂肪對DPPH·的清除率：DPPH·清除率=[1-（D1（517 nm）-D2（517 nm））/D0（517 nm）]×100%。式中：D0（517 nm）為空白試驗組的吸光度;D1（517 nm）為加玫瑰紅景天粗脂肪乙醇溶液組的吸光度;D2（517 nm）為對照組的吸光度。

1.2.5?玫瑰紅景天粗脂肪對羥自由基清除率的測定?用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定玫瑰紅景天粗脂肪對H2O2/Fe2+所產生的羥自由基的清除作用[24]。將玫瑰紅景天粗脂肪用乙醇調配成質量濃度為 0.1 mg/mL 的溶液，將8支潔凈的比色管編號，分別向其中加入1.0 mL鄰二氮菲溶液、3.0 mL PBS，混勻;再逐管加入2.0 mL硫酸亞鐵溶液，混勻;在編號為1～6號的比色管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL玫瑰紅景天粗脂肪溶液;還有2支比色管分別標為損傷管、未損傷管，均不加玫瑰紅景天粗脂肪溶液，分別在1～6號比色管、損傷管中再加入1 mL雙氧水溶液，未損傷管中不加雙氧水溶液。將8支比色管加水定容至10 mL，混勻，放入微生物培養(yǎng)箱中，在控溫37 ℃的條件下持續(xù)反應50 min，取出比色管并冷卻至室溫，在517 nm波長處測定8支比色管中溶液的吸光度。同時，以相同濃度的維生素C乙醇溶液作為參照代替玫瑰紅景天粗脂肪乙醇溶液進行試驗。按下式計算對羥自由基的清除率：羥自由基清除率=（D2（517nm）-D1（517nm））/（D0（517nm）-D1（517nm））×100%。式中：D0（517nm）為未損傷溶液的吸光度，D1（517nm）為損傷溶液的吸光度，D2（517nm）為加玫瑰紅景天粗脂肪溶液的吸光度。

2?結果與分析

2.1?玫瑰紅景天粗脂肪的組分分析

由GC-MS測定的玫瑰紅景天粗脂肪的總離子流圖（圖1）可以看出，共分離和鑒定出48種組分，將各組分的質譜結果用計算機查驗入質譜數據庫，然后依據相似度初步確定類似化合物，隨后查看圖譜中的質荷比、基峰等，再然后通過解析質譜碎片、比對文獻辨認，從玫瑰紅景天粗脂肪中共認定46種化合物，其相對含量占98.9%。如表1所示，玫瑰紅景天粗脂肪的化合物種類復雜多樣，以醇類、醛類、酯類、烯烴類和羧酸類為主，還有酮類、烷烴類、酚類、醚類、酰胺類等，其中有18種醇類、7種酯類、6種醛類、5種烯烴類、4種羧酸類、2種烷烴類，各1種酮類、酚類、醚類和酰胺類。

玫瑰紅景天粗脂肪的主要組分是乙酸二十三醇酯（31.71%）、乙酸二十七醇酯（20.55%）、乙酸二十一醇酯（17.89%）、香葉醇（3.96%）、1-辛醇（2.87%）、1-二十一醇（2.75%）、亞麻酸（2.58%）等，這7種化合物在玫瑰紅景天粗脂肪中的相對含量占總含量的82.31%，其中游離態(tài)乙酸二十三醇酯、乙酸二十七醇酯、乙酸二十一醇酯的相對含量占70.15%。與文獻[22]報道的西藏紅景天揮發(fā)油的主要成分是香葉醇、1-辛醇、芳樟醇等及文獻[19]報道的大花紅景天揮發(fā)油主要成分是1-辛醇、香葉醇等均不同，此外，還有5個種屬12個西藏紅景天樣品的分析結果[25]也不相同，說明玫瑰紅景天粗脂肪有潛在的應用價值。

2.2?玫瑰紅景天粗脂肪的抗菌活性

由表2可以看出，玫瑰紅景天粗脂肪對供試的9種菌株均有明顯的抑制或滅活作用，可有效地殺滅這9種致病細菌。玫瑰紅景天粗脂肪對白色念珠菌ATCC 10231株、金黃色葡萄球菌ATTCC 25925株的MIC分別為0.08、0.16 mg/mL，說明玫瑰紅景天粗脂肪對這2種細菌有強烈的抑制作用，對其他7種細菌的MIC為1.98～10.12 mg/mL，由此可見，玫瑰紅景天粗脂肪對這9種細菌均有抑制作用，這與文獻[20]報道的小叢紅景天脂溶性成分具有很好的抑菌殺菌活性的結果是相同的。從測試的9種菌株的MBC來看，玫瑰紅景天粗脂肪對這9種菌株的殺滅作用排序是白色念珠菌ATCC 10231株>金黃色葡萄球菌ATTCC 25925株>腸炎沙門氏菌50040株>大腸桿菌ATCC 25922株>短小芽孢桿菌 ATCC 7061株>肺炎鏈球菌 ATCC 49619株>肺炎克雷伯氏菌 ATCC 10031株>傷寒沙門氏菌 CMCC 50071株>鼠傷寒沙門氏菌50013株，其中，玫瑰紅景天粗脂肪對白色念珠菌ATCC 10231株的抑制作用和滅活作用表現得最為明顯。

2.3?玫瑰紅景天粗脂肪的抗氧化活性

2.3.1?玫瑰紅景天粗脂肪對DPPH·的清除作用?由圖2可知，不同質量濃度的玫瑰紅景天粗脂肪均有清除DPPH·的作用，玫瑰紅景天粗脂肪的質量濃度和清除率存在量效關系，即隨著玫瑰紅景天粗脂肪質量濃度的增大，對DPPH·清除能力增強，其半抑制濃度（IC50）為0.005 7 mg/mL。玫瑰紅景天粗脂肪對DPPH·的清除效果弱于維生素C，但也能明顯地清除DPPH·，說明玫瑰紅景天粗脂肪有一定的抗氧化活性。

2.3.2?玫瑰紅景天粗脂肪對羥自由基的清除作用?由圖3可知，玫瑰紅景天粗脂肪對羥自由基表現出明顯的清除效果，并且玫瑰紅景天粗脂肪質量濃度與其清除效果間存在量效關系，隨著玫瑰紅景天粗脂肪質量濃度的遞增，其對羥自由基的清除率持續(xù)提高，其IC50為0.010 2 mg/mL，雖然相對于維生素C清除羥自由基的效果有些偏低，但也表現出明顯的清除羥自由基的作用。由此看出，玫瑰紅景天粗脂肪能夠清除羥自由基，有抗氧化活性。

3?結論

本研究借助GC-MS技術鑒定玫瑰紅景天粗脂肪中的46種化合物，結果顯示，粗脂肪中的化合物以醇類、醛類、酯類、烯烴類和羧酸類為主，主要組分是乙酸二十三醇酯（31.71%）、乙酸二十七醇酯（2055%）、乙酸二十一醇酯（17.89%）、香葉醇（396%）、1-辛醇（2.87%）、1-二十一醇（275%）、亞麻酸（2.58%）等，組分復雜多樣，與相關研究報道的紅景天同屬其他植物脂溶性和揮發(fā)油的組分有相似性[19-20]。玫瑰紅景天粗脂肪能有效地抑制和滅活試驗菌株，特別是對白色念珠菌ATCC 10231株的抑制作用和滅活作用更為明顯。玫瑰紅景天粗脂肪對DPPH·、羥自由基的清除率較維生素C均偏低，但也表現出明顯的清除作用;玫瑰紅景天粗脂肪對DPPH·、羥自由基的IC50分別為0.005 7、0.010 2 mg/mL。由本研究結果看出，玫瑰紅景天粗脂肪是一種有抗菌、抗氧化活性的天然活性物質。

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