誘導子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物中的作用機理與應(yīng)用

齊敏杰， 梁 娥 ， 張 來

(1. 貴州師范大學 生命科學學院， 貴陽 550000; 2. 安順學院 功能材料與資源化學貴州省高校特色重點實驗室， 安順 561000； 3.中國科學院 昆明植物所， 昆明 650201)

次生代謝產(chǎn)物是藥用植物的主要藥用成分，目前通過細胞懸浮培養(yǎng)[1]、愈傷組織培養(yǎng)[2]、根細胞培養(yǎng)[3]來調(diào)控藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累已有相關(guān)報道。20世紀80年代出現(xiàn)的毛狀根培養(yǎng)技術(shù)是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的有效途徑[4]；毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的T-DNA片段被整合到寄主植物細胞的核基因組中而產(chǎn)生的[5]。筆者所在團隊研究并總結(jié)了藥用植物毛狀根的培養(yǎng)與應(yīng)用，掌握了毛狀根具有生長速度快、激素自養(yǎng)和遺傳性狀相對穩(wěn)定等優(yōu)點[6]，并對藥用植物竹節(jié)參進行毛狀根誘導，成功培養(yǎng)了竹節(jié)參毛狀根單克隆體系，為極稀少的竹節(jié)參生產(chǎn)皂苷開辟了一條不依賴原植物體的全新有效途徑[7]；同時對竹節(jié)參正常根及毛狀根中精油成分進行了比較分析[8]。誘導子(Elicitor)能快速專一地誘導植物體內(nèi)關(guān)鍵酶基因表達從而導致特定次生代謝產(chǎn)物的積累，這對研究和利用藥用植物特定藥用成分提供了新的思路和策略。

1 誘導子

當受到某種因子刺激時，植物細胞易合成具有抵抗這種因子活性的次生代謝產(chǎn)物，這種因子就是誘導子。

1.1 誘導子的分類

根據(jù)來源的不同，誘導子可分為生物誘導子和非生物誘導子。生物誘導子是來源于微生物或動植物細胞中的物質(zhì)，主要是真菌孢子、細胞壁碎片和真菌絲等；非生物誘導子不是植物細胞中的天然成分，卻可以使植物產(chǎn)生防御化合物，主要有化學誘導子和物理誘導子兩類。常用的化學誘導子有植物生長調(diào)節(jié)劑(Plant growth regulators)、水楊酸(Salicylic acid, SA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate, MJ)等；紫外線輻射、高低溫和溶氧量為物理誘導子。

1.2 誘導子的作用機理

關(guān)于誘導子的作用機理研究較少，目前大家普遍接受的是：誘導子作為外源信號被細胞膜上受體識別并結(jié)合，增強細胞膜的通透性和流動性(Ca2+、H+內(nèi)流和 Cl-、K+外流)；然后細胞內(nèi)的第二信使(G蛋白、磷酸肌醇、cAMP等)把信號傳遞至細胞核；最終激活特異性基因，從而調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物合成(圖1)[9]。誘導子通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶基因的表達來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的積累，因此找到誘導子對植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的合成積累影響過程中的影響因子具有重要意義。如經(jīng)過誘導子處理的煙草葉片中苯丙氨酸解氨酶活性增強，使多酚積累量增加[10]。經(jīng)過flg22誘導處理的擬南芥幼苗，在吲哚族芥子油苷核心結(jié)構(gòu)形成過程中CYP83B1和CYP79B2的表達水平顯著提高，芥子油苷積累量增加[11]。MJ的加入使菘藍毛狀根中CHI和F3′H基因的表達水平上調(diào)，進而促進其黃酮類次生代謝產(chǎn)物積累[12]。劉佳和吳能表[13]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，不同濃度的AgNO3均能提高pmt、trI和h6h基因的表達，從而增加托品烷類生物堿的積累量。

圖1 藥用植物次生代謝產(chǎn)物生物合成的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)模型[9]

2 不同類型的誘導子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

利用誘導子來促進次生代謝產(chǎn)物的積累已成為毛狀根次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)過程中的主要方法之一，目前已經(jīng)在人參、顛茄、紫草和丹參等多種藥用植物中有相關(guān)報道。在研究誘導子對植物代謝影響的過程中，濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)調(diào)控的研究成為人們關(guān)注的焦點。濃度效應(yīng)是指不同濃度的誘導子其作用效果存在差異，特定的濃度能使次生代謝產(chǎn)物的積累量達到最高值；時間效應(yīng)是指在植物適應(yīng)自身生長環(huán)境之后加入誘導子使得次生代謝產(chǎn)物積累量最大化，不同植物對時間效應(yīng)的反應(yīng)速度存在差異，而不同植物的適應(yīng)能力也有所差異，因此需要逐步試驗和摸索。根據(jù)筆者所掌握的文獻資料對誘導子在藥用植物毛狀根中生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)的研究和利用進行歸納和整理。

2.1 生物誘導子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

近年來，在毛狀根培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加入生物誘導子來調(diào)控次生代謝產(chǎn)物積累的研究應(yīng)用較廣。酵母提取物(YE)是常用的生物誘導子之一。劉佳等[14]使用YE誘導顛茄毛狀根生長，發(fā)現(xiàn)一定濃度的YE既能增加顛茄毛狀根的積累又能提高托品烷類生物堿含量。以濃度為100 mg/L 的YE 作用于顛茄毛狀根培養(yǎng)至16 d，莨菪堿和東莨菪堿的產(chǎn)量分別是對照組的3.09 倍和 1.85 倍[15]；以濃度為50 mg/L的YE處理的西洋參毛狀根中人參總皂苷含量是對照組的1.57倍[16]。有學者研究指出霉菌也是較為常用的生物誘導子之一。如在黑曲霉和米曲霉?jié)舛容^低時均能促進新疆紫草毛狀根中萘醌的積累[17]；以濃度為 40 mg/L的黑曲霉和20 mg/L的米曲霉處理黃芩毛狀根，使黃芩苷積累量增加了1.54%和1.17%[18]；閻巖[19]以4%的密旋鏈霉菌Act12的發(fā)酵液和菌絲體混合液處理丹參毛狀根，發(fā)現(xiàn)總丹參酮積累量最高為對照組的12.6倍。細菌作為誘導子的研究相對較少，僅見零星報道。尤紅[20]研究發(fā)現(xiàn)野生丹參內(nèi)生細菌是誘導其毛狀根中丹酚酸積累效果最好的菌株；也有學者發(fā)現(xiàn)用0.2%的蠟樣芽孢桿菌處理丹參毛狀根時，總丹參酮積累量是對照組的13倍[21]。

2.2 化學誘導子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

在藥用植物毛狀根培養(yǎng)體系中，諸多研究者常用植物生長調(diào)節(jié)劑、酯類、酚類和金屬鹽等化學誘導子來促進次生代謝產(chǎn)物的積累。雖然毛狀根具有激素自養(yǎng)的優(yōu)點，但研究發(fā)現(xiàn)，植物生長調(diào)節(jié)劑能促進毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累。如在添加1 mg/L NAA和 1 mg/L BA的情況下，酸漿果毛狀根的澳洲茄胺甙含量是不加激素的 2.6 倍多[22]。李春玲[23]研究發(fā)現(xiàn)加入0.5 mg/L NAA培養(yǎng)時，水飛薊毛狀根中水飛薊賓積累量是對照的1.6倍。MJ可以提高某些特定次生代謝產(chǎn)物含量。熊丙全等[24]在丹參毛狀根的培養(yǎng)液中加入MJ，發(fā)現(xiàn)MJ能顯著提高丹參毛狀根中丹參酮的積累。添加MJ能增加甜葉菊毛狀根中綠原酸類物質(zhì)含量，而添加SA則不能[25]。王瑜[26]研究指出，在王不留行毛狀根培養(yǎng)18 d時，分別加入150 μmol/L MJ和20 mg/mL SA繼續(xù)培養(yǎng)，則黃酮苷的積累量最高可達到對照組的5.32和3.78倍。低濃度的SA能明顯促進水飛薊毛狀根中水飛薊賓積累[23]。

多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，金屬鹽作為誘導子對藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物的積累也有促進作用。如當誘導子AgNO3濃度5 mg/L時，新疆紫草毛狀根中的紫草素、總多酚以及總黃酮的含量都比對照組高[27]；AgNO3的加入雖然抑制了顛茄毛狀根的生長，卻增加托品烷類生物堿的積累量[13]；在丹參毛狀根培養(yǎng)中也有類似現(xiàn)象，即 Ag+在增加丹參毛狀根中迷迭酸、咖啡和阿魏酸的積累量的同時抑制了丹參毛狀根的生長[28]。有研究指出，在天仙子毛狀根培養(yǎng)液中加入50 μmol/L硝普鈉后培養(yǎng)48 h時，發(fā)現(xiàn)毛狀根中東莨菪堿積累量達到最高值并且在對照的基礎(chǔ)上增加了1.2倍[29]；加入100 μmol/L硝普鈉后培養(yǎng)24 h時，則毛狀根中天仙子堿積累量達到最高值并且在對照的基礎(chǔ)上增加了1.5倍。

2.3 物理誘導子在藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝中的應(yīng)用

溫度、光照、溶氧量等物理誘導子對藥用植物毛狀根次生代謝也有一定調(diào)控和影響作用，在三分三、高麗參、雪蓮、黃芪、苦蕎、青蒿等植物毛狀根培養(yǎng)中已有報道。

毛狀根一般的生長溫度是20 ℃～25 ℃，但是不同的藥用植物毛狀根產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的最適溫度是不同的。如三分三在25 ℃培養(yǎng)條件下毛狀根中莨菪堿含量最高，是35 ℃的2.70倍[30]；高麗參毛狀根生物量以及人參皂苷產(chǎn)量在20 ℃/ 13 ℃[日(12 h) / 夜(8 h)]循環(huán)下達到最大值[31]；水母雪蓮毛狀根在24 ℃的培養(yǎng)條件下，毛狀根的生長及總黃酮產(chǎn)量均達到最大值[32]。

一些研究表明，光照對毛狀根生長與合成產(chǎn)物的影響隨著植物種類的不同而有所差異[33]。光質(zhì)和光照強度都會對次生代謝產(chǎn)物合成和積累產(chǎn)生影響。紫外線輻射已被證明是一種用來刺激植物次級代謝產(chǎn)物積累的有效誘導子。焦嬌[34]研究了紫外線(UV-A、UV-B、UV-C)對黃芪毛狀根次生代謝產(chǎn)物異黃酮和皂苷積累的影響，檢測發(fā)現(xiàn)UV-B輻射量在86.4 kJ/m2時，總異黃酮產(chǎn)量是對照組的2.29倍；為54 kJ/m2時，總皂苷產(chǎn)量是對照組的1.30倍。Huang等[35]對苦蕎麥毛狀根進行UV-B脅迫處理發(fā)現(xiàn)蘆丁積累量顯著增加，是對照組的5.18倍；但是槲皮素的積累量僅為對照組的2倍。Yu等[31]研究了6種不同光照條件對人參毛狀根中人參皂苷積累的影響，發(fā)現(xiàn)在熒光燈下的毛狀根中的人參皂苷積累量增加最多。光照條件為3500 lx(18 h/d)時, 雪蓮毛狀根中總黃酮積累量比全黑暗時增加了1.6倍, 僅比全光照時增加了0.2倍[32]。

溶氧量對植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物積累也有一定的影響。如青蒿毛狀根在裝有50 mL培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中培養(yǎng)時，其生長量和青蒿素的積累量均達到最大值[36]。在轉(zhuǎn)速為100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)水母雪蓮毛狀根，具有較高溶氧量使毛狀根生長量和總黃酮積累量均達到最大值[32]。張丹[37]研究發(fā)現(xiàn)當搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為130 r/min時，人參毛狀根鮮重和阜苷積累量均達到最大值。

2.4 誘導子協(xié)同作用在藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用

誘導子的協(xié)同作用是指在誘導子之間存在一定的混合比例對植物毛狀根中次生代謝產(chǎn)物積累的影響效果。目前研究較多的是MJ和SA組合、YE和Ag+組合以及植物激素和其他化學誘導子組合。在人參毛狀根培養(yǎng)液中同時加入0.001 mmol/L MJ和SA，其皂苷含量比二者單獨作用都要高[38]。100 μmol/L MJ和SA組合是促進雷公藤發(fā)狀根中吉堿和次堿總產(chǎn)量積累的最佳組合，分別為對照組的5.33和8.56倍[39]。100 mg/L YE和300 μmol/L Ag+組合處理丹參毛狀根時，使丹參酮Ⅰ的積累量達到最大值，是對照組的13.9倍[40]。也有學者研究了YE和Ag+組合對丹參毛狀根中丹參酮類積累的影響，結(jié)果顯示隱丹參酮積累量達到最大值時為同時期對照組的41.1倍，丹參酮ⅡA積累量達到最大值時為同時期對照組的7.4倍[41]。在植物激素和其他化學誘導子組合研究方面，有學者用0.5 mg/L NAA和1.0 mg/L KT組合、100 μmol/L MJ和30 μmol/L SA組合以及0.5 mg/L NAA和30 μmol/L SA組合均能促進圓葉牽牛毛狀根中咖啡酸和咖啡乙酯的積累，3個組合中0.5 mg/L NAA和30 μmol/L SA組合能使咖啡酸和咖啡乙酯積累量達到最大值[42]。

3 誘導子在藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物中的應(yīng)用前景

隨著人們對天然藥物的高度關(guān)注和認可，其供不應(yīng)求的現(xiàn)象日益凸顯，雖然化學合成方法也有一定的效果，但其工藝流程復雜，成本較高，易造成環(huán)境污染；而誘導子對藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物的積累具有顯著作用；因此利用誘導子調(diào)控藥用植物毛狀根次生代謝產(chǎn)物合成已成為一個新的研究熱點。

目前雖然對大多數(shù)誘導子的作用機制不明確，但是利用誘導子作用于藥用植物毛狀根來促進次生代謝產(chǎn)物積累的技術(shù)迅猛發(fā)展并得到大規(guī)模應(yīng)用，在毛狀根培養(yǎng)液中添加誘導子高效快速地促進次生代謝產(chǎn)物積累已經(jīng)顯現(xiàn)出樂觀的應(yīng)用前景，這不僅提高了藥用植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，還降低了生產(chǎn)成本、取得可觀的經(jīng)濟效益。這些研究為綜合利用誘導子生產(chǎn)藥用成分提供了科學案例和實驗方案。