豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)中I、Ⅲ型膠原檢測方法研究

張 揚(yáng)， 陳 毅， 高建萍， 夏磊磊， 李勇超， 王清石， 張貴鋒， 趙 博

(1. 北京博輝瑞進(jìn)生物科技有限公司， 北京 100026； 2. 中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室， 北京 100190； 3. 河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院， 新鄉(xiāng) 453003)

豬小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)(SIS, Small intestinal submucosa)是豬小腸黏膜下層去除免疫原性物質(zhì)后的生物材料，可誘導(dǎo)細(xì)胞黏附生長、促進(jìn)組織再生，廣泛用于各種軟組織缺損的修復(fù)[1-3]。膠原是動物組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重要結(jié)構(gòu)蛋白，約占其總蛋白的25%～30%，主要存在于皮膚、骨、肌腱及結(jié)締組織等部位[4-6]，其自身具有良好的生物相容性和低免疫原性[7]，在高溫、酸、堿或酶等條件下可被降解，性能也隨之改變。大量研究表明，膠原作為敷料可抑制潰瘍、調(diào)節(jié)T細(xì)胞抗炎因子釋放以改善關(guān)節(jié)炎并增加骨密度，通過增強(qiáng)NK細(xì)胞活性提高免疫力，被用作止血、藥物緩釋以及組織工程和化妝品等材料[7-10]。

目前確認(rèn)的膠原類型有27種，其中Ⅰ、III型是ECM中兩種主要膠原，其比例與組織修復(fù)質(zhì)量相關(guān)[11-13]。文獻(xiàn)報道的膠原類型鑒別和定量方法主要包括基于溴化氫降解的多肽分析法，基于光度分析的羥脯氨酸(Hyp)比色法、高效液相色譜法(HPLC)、免疫學(xué)檢測法及基于化學(xué)染色的天狼星紅法等[4,14-15]。目前最常用的方法是羥脯氨酸比色法，但不同來源或組織的膠原中所含Hyp的比例也不同，而且過程繁瑣，樣品水解程度對結(jié)果影響較大，故該方法準(zhǔn)確性不高[16]；免疫學(xué)檢測法以膠原作為抗原，利用其和抗體結(jié)合顯色來檢測膠原含量，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但重復(fù)性較差且不適用于組織樣本[17]；天狼星紅法靈敏度較高，對Ⅰ、Ⅲ膠原染色特異性強(qiáng)，但其檢測結(jié)果與組織切片厚度和位置相關(guān)，不適用于非均勻組織的膠原含量分析[18]。因此，建立一種組織膠原的類型及含量檢測方法尤為必要。

本實(shí)驗中膠原被胰蛋白酶特異性降解，再通過高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)檢索和識別Ⅰ、III型膠原的特征多肽并進(jìn)行定量分析，可識別動物組織ECM中不同類型膠原并準(zhǔn)確定量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料與試劑

SIS(VIDASISTM)取自北京博輝瑞進(jìn)生物科技有限公司；SIS(Biodesign?)購自美國庫克公司；Ⅰ、Ⅲ型膠原標(biāo)準(zhǔn)樣品購自YO Proteins AB公司；胰蛋白酶(序列純)購自Promega公司(美國)。

1.1.2 主要儀器

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HPLC-MS)由1100液相色譜(美國Agilent公司)和LCQ DecaXP電噴霧質(zhì)譜(美國Thermo Fisher公司)組成，數(shù)據(jù)處理軟件Xcalibur 3.0；液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)由U3000液相(美國Thermo Fisher公司)和TSQ Quantum ACCESS MAX質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)處理軟件為Xcalibur 3.0。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 氨基酸組成分析

稱取10 mg樣品于安培瓶中，加入2 mL HCl(6 mol/L)，110 ℃條件下水解12 h，用6 mol/L NaOH 調(diào)至pH 7.0～8.0，60 ℃避光衍生1 h。通過HPLC檢測Hyp含量，根據(jù)Hyp比例對樣品中總膠原進(jìn)行定量[15,19]。

1.2.2 胰蛋白酶酶解

SIS、豬跟腱及真皮ECM粉碎后分別稱取10 mg，加入10 mL NH4HCO3緩沖液(50 mmol/L, pH 8.0)，100 ℃變性10 min，冷卻至室溫后按照50∶1的比例加入胰蛋白酶，37 ℃酶解16 h，酶解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-MS分析[1]。

1.2.3 分析方法

1)羥脯氨酸HPLC分析條件

色譜柱為Zorbax C18 [250 mm×4.6 mm(I.D.)，5 μm]；流動相A：0.05 mol/L乙酸鈉溶液，流動相B：乙腈∶水(1∶1，V/V)；梯度0～15 min， 30% ～55% B，15～25 min， 55%～100% B，25～35 min， 100% ～30% B，進(jìn)樣量5 μL；UV為360 nm；流速1 mL/min。

2)HPLC-MS質(zhì)譜條件

色譜柱為Zorbax SB C18 [150×2.1 mm(I.D.)，5 μm]；流動相A：水(含0.1%甲酸)，流動相B：60%乙腈(含0.1%甲酸)；梯度0～120 min，5%～100% B；進(jìn)樣量50 μL；流速0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源噴霧電壓4.5 kV，毛細(xì)管溫度300 ℃，掃描范圍m/z 300～2000，精確質(zhì)量數(shù)掃描和二級質(zhì)譜掃描均為數(shù)據(jù)依賴型掃描，碰撞能量為35%。選擇離子掃描，Ⅰ型膠原特征多肽的 m/z為773.90，Ⅲ型膠原特征多肽的 m/z為533.09。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法檢測Hyp

Hyp是膠原的特征氨基酸，其在哺乳動物膠原中的比例約為12%，幾乎不存在于其他蛋白質(zhì)[14,17]。本實(shí)驗通過HPLC法檢測定VIDASISTM和Biodesign?兩種SIS產(chǎn)品中的Hyp含量，經(jīng)換算得到其膠原含量分別為87.16%±1.31%和89.93%±1.99%。

2.2 基于質(zhì)譜的檢測方法

2.2.1 Ⅰ、III型膠原特征多肽篩選

將豬膠原標(biāo)準(zhǔn)品的酶解產(chǎn)物用離子阱質(zhì)譜Full Scan模式進(jìn)行檢測，圖 1為豬膠原標(biāo)準(zhǔn)品酶解多肽的總離子流圖。

圖1 豬膠原標(biāo)準(zhǔn)品酶解多肽總離子流圖

膠原經(jīng)變性處理后可被胰蛋白酶(序列純)降解，酶解產(chǎn)物中存在大量分子量接近、等電點(diǎn)和親疏水性相似的多肽；實(shí)驗對多肽進(jìn)行BLAST序列比對，確定豬I、III型膠原特征肽。膠原酶解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離后，多肽逐一通過質(zhì)譜進(jìn)行檢測，在質(zhì)譜圖中形成不同質(zhì)荷比的離子信號，多肽質(zhì)譜信息用搜庫軟件結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索，多肽過濾參數(shù)參考文獻(xiàn)[1,15]，Xcorr>1.5(單電荷)，Xcorr>2.0(2個電荷)，Xcorr>2.5(3個電荷)，同時Deltacn>0.1，信噪比S/N>10，滿足要求的肽段視為陽性結(jié)果，即可作為候選特征多肽，多個符合條件的候選肽段又宜選擇肽段較短、羥基化位點(diǎn)較少、二級碎片離子匹配度較高的肽段。特征多肽通過選擇離子監(jiān)測模式檢測可提高低濃度樣品的信號強(qiáng)度。

采用上述方法得到豬I、III型膠原的特征多肽分別為GETGPAGPAGPVGPVGAR、GPPGAVGPSGPR。圖 2和圖 3分別為豬I型膠原標(biāo)準(zhǔn)品特征多肽經(jīng)質(zhì)譜分析后獲得的提取離子流圖以及二級質(zhì)譜圖。

圖2 豬Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品特征肽段的提取離子流圖及含一級質(zhì)譜圖

2.2.2 豬膠原特征多肽濃度與信號強(qiáng)度關(guān)系

分別對豬I、III型膠原特征多肽的目標(biāo)離子m/z 773.9和533.09進(jìn)行選擇離子監(jiān)測，以樣品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作線性回歸曲線。圖4和圖5分別為豬I型膠原特征多肽GETGPAGPAGPVGPVGAR的提取離子流圖和線性回歸曲線[y=171.04x+4.154(R2=0.9984)]，二者線性關(guān)系良好。利用相同的方法得到豬III型膠原的線性回歸曲線為y=41.54x+1.63(R2=0.9981)。按照1.2.2中的方法處理樣品，進(jìn)行定量分析。

圖3 豬Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品特征肽段的二級離子質(zhì)譜圖

2.2.3 豬不同組織ECM中膠原類型及含量檢測結(jié)果分析

VIDASISTM中Ⅰ、III型膠原分別為28.09%±0.67%和59.5%±1.42%，Biodesign?中Ⅰ、III型膠原分別為27.56%±0.60%和65.71%±1.56%，Ⅰ、Ⅲ型膠原的總和與HPLC法檢測的總膠原含量較接近。Ⅲ型膠原主要存在于血管、淋巴管和腸胃ECM中，而豬小腸黏膜下層是小腸多層膜結(jié)構(gòu)之一，其內(nèi)存在大量的血管和淋巴管，因此，III型膠原在SIS中含量較高。

圖4 不同濃度Ⅰ型膠原特征多肽GETGPAGPAGPVGPVGAR提取離子流圖

圖5 Ⅰ型膠原特征多肽GETGPAGPAGPVGPVGAR濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

為進(jìn)一步驗證該方法的可行性，對豬不同組織中Ⅰ、III型膠原的含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，豬跟腱ECM中Ⅰ、III型膠原的含量分別為59.13%±1.38%和2%，此結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，跟腱中膠原約占其干重的70%，其中Ⅰ型膠原占總膠原的95%左右，III型膠原低于4%[20-21]。豬真皮ECM中Ⅰ、III型膠原含量分別為54.87%±1.31%和26.54%±0.35%，此結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致，真皮中III型膠原的含量與年齡相關(guān)，胎兒期最高可達(dá)50%左右，隨著年齡的增長Ⅰ型膠原逐漸增加，有研究表明老年人皮膚中Ⅰ、Ⅲ型膠原的比值為2.97±0.40[22-23]。SIS和豬跟腱、真皮ECM中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量檢測結(jié)果符合膠原在動物組織中的分布規(guī)律。

2.3 方法學(xué)實(shí)驗

2.3.1 精密度

按照2.2.2的方法，對樣品中m/z 553.09的肽段重復(fù)檢測3次。圖6為樣品中m/z 533.09質(zhì)譜圖，峰面積相對偏差RSD=2.38%，表明該方法精密度較高。

圖6 基于HPLC-MS的膠原檢測方法精密度分析

2.3.2 穩(wěn)定性

將膠原酶解產(chǎn)物置于-20℃保存，分別于1、10、15和20 d取樣，對III型膠原特征多肽GPPGAVGPSGPR進(jìn)行檢測，峰面積分別是2.2×108、2.0×108、1.98×108和2.3×108，證明該方法穩(wěn)定。

3 討論

膠原和細(xì)胞外基質(zhì)是當(dāng)前植入性醫(yī)用材料的熱點(diǎn)，其本身具有低免疫原性和可降解性，可促進(jìn)組織再生。目前，組織膠原的定性、定量檢測還主要依賴于膠原的特征氨基酸Hyp的測定、免疫學(xué)檢測和化學(xué)染色等方法[24]。本研究建立的基于HPLC-MS的膠原特征多肽檢測方法，可以特異性地檢測不同類型膠原的含量，將類型識別和定量檢測結(jié)合到同一方法中，操作簡便。

由于不同動物來源的膠原氨基酸序列不同，該方法通過特征多肽不僅可以對組織或材料進(jìn)行膠原成分表征，還可動態(tài)監(jiān)測膠原材料在體內(nèi)的降解情況，降低動物自身膠原對其檢測的影響，在一定程度上補(bǔ)充天狼星紅染色等方法的不足[25]。此外，通過該方法檢測特定組織中不同類型膠原的含量，可輔助某些膠原相關(guān)疾病的診斷和治療[26]。