膠原海綿與脫細(xì)胞基質(zhì)在大鼠體內(nèi)的降解過程

馬 也， 趙磊磊， 高建萍， 孔英俊， 張貴鋒， 劉 濤

(1. 廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 廣州 510000； 2. 中國科學(xué)院 過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室， 北京 100190； 3. 河北考力森生物科技有限公司， 邯鄲 057450)

膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分主要存在于動物的結(jié)締組織中，是哺乳動物體內(nèi)含量最多的蛋白。膠原具有生物可降解性及生物相容性，特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)使其具有一定的機械強度和可塑性，因此廣泛用于生物材料和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1-2]。脫細(xì)胞基質(zhì)是通過物理或化學(xué)等方法將組織內(nèi)的細(xì)胞成分去除僅保留含膠原三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)，其主要成分是不同類型的膠原，同時還包含少量纖維連接蛋白、層黏蛋白以及微量或痕量的生長因子和細(xì)胞因子等,這些成分含量和特性相對穩(wěn)定[3-4]。近年來，膠原和脫細(xì)胞基質(zhì)作為重要的生物材料日益引起廣泛關(guān)注，其體內(nèi)降解過程是影響材料應(yīng)用的關(guān)鍵。在進(jìn)行體內(nèi)植入后若降解過快，在一定時期內(nèi)力學(xué)強度急劇下降,而此時成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)達(dá)不到自體組織的要求，降解過慢則會影響組織的再生修復(fù)并引發(fā)排異、包裹等免疫反應(yīng)。因此研究膠原基生物材料的體內(nèi)降解過程,對于提升降解過程與受體的自體組織形成過程協(xié)調(diào)性，保證組織形成前保持材料特性并使其在組織形成后自行降解具有重要意義[5-8]。

膠原基材料在體內(nèi)降解的研究遠(yuǎn)少于體外。樊立濤等通過新西蘭兔腹壁植入實驗觀察脫細(xì)胞豬皮基質(zhì)材料的降解情況，以目測材料的降解程度，此方法僅能粗略估計降解周期，無法準(zhǔn)確定量[9]。覃廣兵等通過橈骨缺損區(qū)X射線觀察不同時間點材料的降解情況，相比直接取出材料更加便捷，而且能保持材料在體內(nèi)的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，直接觀察體內(nèi)材料的降解程度，但此方法同樣無法定量[10]。張楠等在微弧氧化涂層鎂合金替代骨缺損修復(fù)的體內(nèi)降解實驗中于4、8和12周取出材料，通過剩余植入物體積來定量降解殘留，由于此材料機械強度高，且在體內(nèi)降解過程中受到組織間影響較少，所以此方法可較準(zhǔn)確定量且現(xiàn)階段大部分表征體內(nèi)降解周期都是運用此方法，但膠原基材料在體內(nèi)降解過程中存在組織包裹較多、材料機械強度低、可塑性差、無法完全剝離組織與材料等情況，運用該方法存在較大誤差[11]。郭永偉等在研究不同孔徑的再生絲素蛋白支架的體內(nèi)降解實驗中通過傳統(tǒng)的石蠟和蘇木精伊紅(H&E)染色，通過圖像助手軟件進(jìn)行定量分析。但在做組織學(xué)切片的過程中會造成無法完全染色，而且在拍照的時候即使選擇陽性區(qū)域與陰性區(qū)域的混合也難以代表整個切片，所以此方法僅適用于半定量[12]。

本研究針對膠原基材料的特性，擬建立一種基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對材料中的特征多肽GEGGPQGPRG定量來表征材料在大鼠體內(nèi)降解過程的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

10周齡SD雄性大鼠21只，體質(zhì)量200～250 g，實驗動物(合格證號：NO.1103241911012185)購自北京通和立泰生物科技有限公司。

膠原海綿為河北考力森生物科技有限公司提供，脫細(xì)胞基質(zhì)材料由煙臺正海生物科技股份有限公司提供。

胰蛋白酶(序列純)購自美國Promega公司；特征多肽GEGGPQGPRG由上海強耀生物科技有限公司提供；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HPLC-MS)由美國Agilent公司 1100液相色譜和美國Thermo Fisher公司LCQ DecaXP電噴霧質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為Xcalibur 1.3；液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)由美國Thermo Fisher公司U3000液相和TSQ Quantum ACCESS MAX質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為Xcalibur 1.3；其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 膠原海綿和脫細(xì)胞基質(zhì)體內(nèi)埋植實驗

將兩種材料切成規(guī)格1 cm×1 cm，將所選SD大鼠隨機均分為3組，麻醉后，剔除背部被毛，碘酒消毒，手術(shù)沿脊柱切開皮膚，切口長約5 cm，實驗組A在鼠脊柱兩側(cè)約2 cm處等距離各選1個植入點分別皮下植入膠原海綿與脫細(xì)胞基質(zhì)，分離皮下組織與筋膜，縫合線縫合材料與皮下筋膜，最后縫合背部皮膚，創(chuàng)口用碘酒消毒，埋植情況如圖1-a。實驗組B、C與A實施同樣手術(shù)。實驗后連續(xù)3 d每只注射青霉素50 000 U/(kg·d)，以防感染。術(shù)后觀察創(chuàng)面愈合情況，術(shù)后0、1、2、4、6、8、12和16周每次分別從3組中取材1只，頸椎脫臼處死，盡量分離皮下筋膜與材料，取材后冷凍干燥并稱重每一時間點材料建立降解率曲線并觀察埋植部位材料的吸收降解情況。

1.2.2 特征多肽篩選實驗

稱取牛膠原海綿1 mg，加入0.05 mol/L NH4HCO3(pH 8.0)緩沖液400 μL于100 ℃水浴中熱變性處理15 min，取出冷卻至室溫，加入20 μg胰蛋白酶與600 μL緩沖液于37 ℃下酶解18 h，酶解產(chǎn)物離心10 min，10 000 r/min上清液進(jìn)行HPLC-MS分析，分析結(jié)果通過Sequest數(shù)據(jù)庫篩選肽段。

離子阱質(zhì)譜(Ion Trap Mass Spectrometry, LCQ)條件如下，色譜柱：Zobarx SB C18 (150 mm×2.1 mmI.D，5 μm)；流動相A:水(含0.1%三氟乙酸)，流動相B：乙腈(含0.1% 三氟乙酸)；梯度：0～80 min，5%～50%流動相B，80～90 min，50%～90%流動相B，90～100 min，90%～90% 流動相B；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50 μL。多肽篩選質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，噴霧電壓4.5 kV，加熱電壓15 V，離子導(dǎo)入電壓(Skimmer電壓)20 V，鞘氣流速19.8 mL/min，輔助氣流速5 psi，離子傳輸毛細(xì)管溫度300 ℃。當(dāng)篩選特征多肽時離子的監(jiān)測模式參數(shù)中設(shè)立3個Scan event，Scan event1為一級質(zhì)譜全掃描，掃描范圍m/z 300～2000，正離子監(jiān)測Scan event 2和3為數(shù)據(jù)依賴型精確質(zhì)量數(shù)掃描和二級質(zhì)譜的掃描均采用全掃描模式。

1.2.3 特征肽定量檢測實驗

從0、2、4、6、8、12和16周分別取樣冷凍干燥后分批次酶解前處理同1.2.2方法，后上清液進(jìn)HPLC-MS分析

三重四極桿質(zhì)譜(Triple quadrupole mass spectrometry, TSQ)條件如下，色譜柱：Zorbax SB C18 (150×2.1 mmI.D.，5 μm)；流動相A：水(含0.1%甲酸)，流動相B：60%乙腈(含0.1%甲酸)；梯度：0～35 min，5%～100% 流動相B；進(jìn)樣量10 μL；流速0.2 mL/min。質(zhì)譜條件：離子源噴霧電壓4.5 kV，毛細(xì)管溫度300 ℃，掃描范圍m/z 300～2000。選擇離子掃描，特征多肽m/z 854.42是單電荷離子，m/z 427.71 是雙電荷離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料降解分析

膠原海綿呈乳白色狀，質(zhì)地較軟，韌性較低(圖1-b)。脫細(xì)胞基質(zhì)呈白色，質(zhì)地較硬，韌性較高，更為致密(圖1-f)，2周后膠原海綿輪廓有明顯變形，材料可見。材料與組織間未形成包裹，組織周圍未發(fā)現(xiàn)紅腫，無明顯免疫炎癥反應(yīng)(圖1-c)。2周后脫細(xì)胞基質(zhì)輪廓無明顯變化，材料仍清晰可見，材料與組織間可輕易分離，組織周圍未發(fā)現(xiàn)紅腫、包裹等明顯免疫炎癥反應(yīng)(圖3-g)。4周后膠原海綿輪廓可見但已喪失基本形態(tài)，材料隱約可見，致密度明顯變低，降解后的材料碎裂成塊狀，組織與材料間無明顯免疫炎癥反應(yīng)(圖1-d)。4周后脫細(xì)胞基質(zhì)輪廓有明顯變形，材料仍清晰可見，材料與組織筋膜間形成粘連，材料開始進(jìn)入肉眼可見的降解階段，無明顯免疫炎癥反應(yīng)(圖3-h)。6周后膠原海綿材料完全與筋膜重疊，僅能通過縫合線位置判斷材料位置，無明顯免疫炎癥反應(yīng)(圖1-e)。6周后脫細(xì)胞基質(zhì)輪廓漸不規(guī)則，但材料仍清晰可見。材料本身厚度明顯變薄，機械強度明顯下降，已逐漸被受體組織吸收，覆蓋，無明顯免疫炎癥反應(yīng)(圖3-i)。8周后脫細(xì)胞基質(zhì)輪廓逐漸喪失基本形態(tài)，材料可見，致密程度降低，部分材料降解已暴露出組織，無明顯免疫炎癥反應(yīng)(圖1-j)。12周后脫細(xì)胞基質(zhì)材料隱約可見，材料已無規(guī)則形狀，完全貼附在組織筋膜上，難完全分離，未降解部分碎裂，變薄，致密程度大幅降低(圖3-k)。16周后脫細(xì)胞基質(zhì)材料不可見，僅能通過縫合線位置判斷材料位置(圖3-l)。可見膠原海綿6周降解較為完全，脫細(xì)胞基質(zhì)16周降解較為完全。

2.2 失重法降解過程分析

兩種材料不同時間點取樣，樣品冷凍干燥稱重。膠原海綿0周(8.6±0.2) mg,1周(7.3±0.4) mg，2周(6.2±0.4) mg，4周(2.1±0.9) mg，6周(0±1.2) mg。脫細(xì)胞基質(zhì)0周(14.5±0.1) mg，2周(12.7±0.3) mg，4周(8.9±0.4) mg，6周(6.8±0.2) mg，8周(4.2±0.4) mg，12周(0.2±1.5) mg，16周(0±1.9) mg。膠原海綿2～4周降解速度最快，6周時已無法分離材料間組織，與筋膜完全重疊，稱量誤差較大，質(zhì)量趨近于0。脫細(xì)胞基質(zhì)材料2～4周降解速度最快，4～12周趨于平穩(wěn)，但16周后材料已經(jīng)完全碎裂成小塊，稱量誤差較大，質(zhì)量趨近于0。由此得出結(jié)論膠原海綿降解周期為6周，脫細(xì)胞基質(zhì)降解周期為16周。失重法體內(nèi)降解曲線如圖2。

a：體內(nèi)埋植示意圖；b-e：膠原海綿0、2、4和6周降解示意圖；f-l：脫細(xì)胞基質(zhì)0、2、4、6、8、12和16周降解示意圖

圖2 失重法體內(nèi)降解曲線

2.3 特征肽篩選實驗

膠原海綿主要成分為牛I型膠原，膠原經(jīng)胰酶酶解處理后產(chǎn)生大量低分子量的多肽肽段，篩選肽段應(yīng)符合以下條件：多肽質(zhì)譜信息用sequest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，當(dāng)搜索結(jié)果用如下參數(shù)進(jìn)行過濾時，所產(chǎn)生的肽段被認(rèn)為是陽性結(jié)果，即當(dāng)多肽帶1個電荷(charge=1)時，Xcorr>1.5；帶2個電荷(charge=2)時，Xcorr>2.0；帶3個電荷(charge=3)時，Xcorr>2.5。多肽分子量在2000 u以下，分子量過大，二級碎片離子過多，造成數(shù)據(jù)庫檢測不準(zhǔn)確。羥基化修飾位點少。最低檢測限可被檢出且多肽豐度高[13]。按以上條件篩選得到特征多肽候選肽段見表1。

表1 所選特征多肽候選多肽段信息

P1、P2發(fā)生羥基化修飾過多不利于定量。對P3進(jìn)行HPLC-MS分析，m/z 854.42是單電荷離子，m/z 427.71 是雙電荷離子，與帶單電荷離子相比，離子m/z 427.71 的二級質(zhì)譜圖中的碎片離子信號強度較高，更易被檢測出。P3肽段 GEGGPQGPR 肽鏈短小，分子量適合，無羥基化修飾，且為牛源特征肽，不存在于大鼠中。提取離子流圖與一級質(zhì)譜圖(圖3)，二級質(zhì)譜圖(圖4)結(jié)果與理論值匹配度較高，可用作特征肽段。

圖3 特征多肽GEGGPQGPR提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖

圖4 特征多肽GEGGPQGPR二級質(zhì)譜圖

2.4 特征肽濃度與信號強度關(guān)系

圖5為不同濃度特征多肽GEGGPQGPR的提取離子流圖，線性回歸曲線(y=2178.3x-0.2438，R2=0.999)，線性關(guān)系良好。

2.5 膠原海綿與脫細(xì)胞基質(zhì)體內(nèi)降解曲線

將0、2、4、6和8周膠原海綿樣品與0、2、4、6、8、12及16周脫細(xì)胞基質(zhì)樣品按1.2.2方法處理后進(jìn)HPLC-MS分析，分別將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到脫細(xì)胞基質(zhì)0周特征肽濃度(4.20±0.10)×10-3mg/mL，2～4周降解速度最快，8周后趨于平緩，16周時特征肽濃度(1.30±0.11)×10-5mg/mL趨近于0 mg/mL判斷已基本完全降解。膠原海綿0周特征肽濃度(2.79±0.09)×10-3mg/mL，同樣2～4周降解速度最快，4周后趨于平緩，8周時特征肽濃度(0.40±0.10)×10-5mg/mL，趨近于0， 判斷已基本降解。兩種材料降解曲線見圖6。

圖5 不同濃度特征多肽GEGGPQGPR提取離子流圖

圖6 膠原海綿與脫細(xì)胞基質(zhì)體內(nèi)降解曲線

3 討論與結(jié)論

膠原基材料常用于組織工程領(lǐng)域，隨著臨床需求量的增加，出現(xiàn)過部分副反應(yīng)，如腸梗死、腸瘺、腹壁粘連等，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)與材料降解率有關(guān)[14]，因此研究其降解規(guī)律極其重要。本研究通過對膠原基材料的降解過程進(jìn)行研究，對每一時間點材料降解程度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以期為其在受體內(nèi)的降解時程提供依據(jù)，使其降解過程與受體組織自愈過程相協(xié)調(diào)來符合臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)要求[15]。

目前研究膠原基材料的體內(nèi)降解周期還主要依賴于宏觀觀察、Micro-CT掃描觀察、材料降解丟失體積、H&E染色法及同位素標(biāo)記法等[10,12,14,16]。本實驗中運用的特征肽法是針對于膠原基材料特有的特征多肽進(jìn)行定量，此多肽僅存在于材料中而不存在于受體實驗動物中，故實驗動物及其植入部位周圍組織不會對定量產(chǎn)生影響，因此該方法對膠原基材料在降解過程中受到受體動物的組織覆蓋、包裹的干擾很小。此外，針對不同動物源的膠原基材料都可以實現(xiàn)準(zhǔn)確定量，精密度高。本實驗中，我們選擇膠原海綿與脫細(xì)胞基質(zhì)材料作為研究對象，通過宏觀觀察體內(nèi)降解周期得出結(jié)論：膠原海綿6周幾乎降解完全，脫細(xì)胞基質(zhì)16周幾乎降解完全，但是材料的降解規(guī)律無法得到。體內(nèi)降解失重實驗中，膠原海綿0～2周降解速率緩慢；而2～4周的體內(nèi)降解速率明顯高于其他時間點；4～6周減緩，稱重誤差較大；第6周幾乎完全降解，膠原海綿降解周期基本為6周。脫細(xì)胞基質(zhì)0～2周降解緩慢；2～4周降解速率最快；4～8周速度減緩；12和16周稱重誤差較大；第16周幾乎完全降解，其降解周期基本為16周。特征肽法實驗中，膠原海綿與脫細(xì)胞基質(zhì)的降解趨勢同失重法，但能準(zhǔn)確定量降解后期兩種材料的殘留特征肽濃度，由此得出膠原海綿降解周期8周，脫細(xì)胞基質(zhì)降解周期16周。通過對比3種方法確定特征肽法更適用于膠原基材料體內(nèi)降解周期的定量。

綜上所述，本研究所建立的特征多肽法不受材料形式限制，還可應(yīng)用于膜、補劑等膠原基材料[17-18]，能準(zhǔn)確定量，精確度高。此外，該方法還可以根據(jù)材料的應(yīng)用需求，通過膠原基材料間的交聯(lián)來調(diào)控降解周期，以期達(dá)到與實際應(yīng)用相匹配的效果。還可應(yīng)用在可生物降解的人工神經(jīng)導(dǎo)管、無定形材料水凝膠、膠原基材料補片、膠原蛋白復(fù)合支架等[19-22]。