煤矸石及其自燃風(fēng)化土中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與解磷抗鎘特性

姜彬慧， 姜 琦， 周星星， 施 洋

(東北大學(xué) 資源與土木工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110819)

煤矸石是夾雜在煤系地層中與煤系地層共生的巖石，在煤炭開采和洗選過程中產(chǎn)生的固體廢棄物約占煤炭總產(chǎn)量的10%～15%，是目前我國(guó)排放量最大的固體廢棄物之一.預(yù)計(jì)到2020年，中國(guó)的煤矸石總產(chǎn)量將達(dá)到7.29億t[1].大量煤矸石的堆積會(huì)嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境，損害人類身體健康.煤矸石主要由碳質(zhì)頁巖、泥質(zhì)頁巖、砂質(zhì)頁巖、煤炭及砂巖等沉積巖組成，發(fā)熱量為4.19～12.6 MJ/kg.由于各種因素的影響，長(zhǎng)期堆積的煤矸石會(huì)發(fā)生氧化，從而導(dǎo)致整體溫度超過1 000 ℃而發(fā)生自燃.在煤矸石自燃過程中，有機(jī)物和礦物質(zhì)都會(huì)發(fā)生氧化和熱變化，產(chǎn)生的有毒有害氣體導(dǎo)致大氣和水體污染，是每個(gè)煤炭生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)必須面臨的又一重大問題[2].目前煤矸石堆積產(chǎn)生的一系列環(huán)境問題已經(jīng)成為當(dāng)前資源開采引發(fā)的環(huán)境熱點(diǎn)問題[3-4]，因此，對(duì)煤矸石山的治理刻不容緩.

由于煤矸石風(fēng)化土的結(jié)構(gòu)性差，保水保肥的能力較低，缺乏植被生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5].復(fù)墾時(shí)的土壤比較貧瘠，植物生長(zhǎng)緩慢，需要補(bǔ)充大量客土，成本高，生態(tài)恢復(fù)周期長(zhǎng)等制約矸石山的生態(tài)恢復(fù)進(jìn)程，而土壤的養(yǎng)分狀況與煤矸石山生態(tài)系統(tǒng)的演替及生態(tài)恢復(fù)息息相關(guān).為了提高植物生長(zhǎng)速度，加快矸石山的生態(tài)恢復(fù)，提高土壤的有效磷含量是行之有效的方法之一.磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，植物吸收的磷主要來自土壤，而土壤中絕大部分的磷是以植物難以直接吸收利用的無效磷形式存在[6].此外，當(dāng)土壤中含有較高濃度的重金屬(如Cd)時(shí)，通過抑制植物生長(zhǎng)過程中對(duì)土壤中鐵的吸收，使土壤中的鐵氧化物會(huì)和有機(jī)酸及磷形成絡(luò)合物，增加磷的沉積，進(jìn)而導(dǎo)致磷的缺乏[7-8].解磷細(xì)菌(phosphate solubilizing bacteria，PSB)不僅能夠有效地將土壤中無效的磷素轉(zhuǎn)化為植物可利用態(tài)，而且還能夠促進(jìn)植物對(duì)Cd污染土壤的修復(fù).Boggess等[9]研究表明在低磷的條件下，土壤中的Cd會(huì)顯著降低植物的生長(zhǎng)量，而向土壤中添加磷的刺激，能夠增加植物干重，降低Cd的毒性.Jeong等[10]研究表明，巨大芽孢桿菌作為PSB，能夠促進(jìn)土壤可溶性磷的釋放，增加污染土壤中Cd的生物利用度，提高植物對(duì)Cd的吸收能力.Li等[11]的研究也證明了PSB能夠通過分泌有機(jī)酸，促進(jìn)污染土壤中Cd的遷移能力及Cd的生物修復(fù).目前，許多學(xué)者已經(jīng)篩選出具有解磷能力的細(xì)菌及真菌等微生物，芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等都是有效的磷酸鹽增溶菌劑，通過產(chǎn)生有機(jī)酸，溶解不溶性磷酸鹽是PSB的解磷機(jī)理[9,12].本文首次從撫順西露天煤礦內(nèi)排土場(chǎng)堆積的煤矸石及煤矸石自燃風(fēng)化土中分離得到3株細(xì)菌，在對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定、生理生化特征分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了菌株的解磷能力及對(duì)重金屬Cd的抗性，為抗重金屬生物磷肥的研制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1 材料及方法

1.1 材 料

1) 土樣:2018年10月采集于遼寧撫順西露天礦區(qū)南部千臺(tái)山排土場(chǎng)堆積的煤矸石風(fēng)化土(MF)及煤矸石自燃風(fēng)化土(MZ)，經(jīng)除雜、破碎、研磨，過0.841 mm篩備用.MF和MZ的養(yǎng)分及重金屬Cd含量[13]見表1.

表1 煤矸石風(fēng)化土及煤矸石自燃風(fēng)化土養(yǎng)分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及重金屬Cd的質(zhì)量比

2) 培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基包括牛肉膏5.00 g，蛋白胨10.00 g，氯化鈉5.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4；無機(jī)磷液體培養(yǎng)基包括葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，MgSO47H2O 0.1 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母膏 0.5 g，F(xiàn)eSO47H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5.

1.2 菌種的分離、純化及分類鑒定

稱取10 g經(jīng)過處理的土樣，分別加入90.0 mL去離子水，于160 r/min，30 ℃下振蕩24 h，取上清液，將每個(gè)樣品稀釋100～10 000倍，制成菌懸液，于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上涂布，培養(yǎng)24 h.觀察菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)菌落進(jìn)行平板劃線，分離純化至少2代以上，保存于4 ℃冰箱備用.

采用革蘭氏、芽孢及莢膜染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)；利用PCR儀進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，將得到的序列結(jié)果在NCBI的網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，并用軟件MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用API20E(Bio-Merieux)試劑盒及GP2 鑒定板(Biolog) (方法參照公司說明書)檢測(cè)菌株的生理生化特性.

1.3 細(xì)菌溶磷量的測(cè)定

將純化后的細(xì)菌利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，制成菌懸液，將體積分?jǐn)?shù)為1%的菌懸液(OD600為1.0～1.4)加入到100/250 mL無機(jī)磷培養(yǎng)基中，在120 r/min，30 ℃的條件下連續(xù)振蕩培養(yǎng)6 d，每24 h取樣一次.取出的樣品經(jīng)10 000 r/min，4 ℃離心5 min，吸取上清液1.5 mL，通過鉬銻抗比色法測(cè)定并計(jì)算原始溶液中有效磷的濃度.

1.4 細(xì)菌對(duì)Cd2+的耐受性檢測(cè)

在含有Cd2+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，逐步提高Cd2+的質(zhì)量濃度(5，10，20，30，50和100 mg/L)，對(duì)已分離純化出的菌株進(jìn)行梯度馴化培養(yǎng)，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況，確定其對(duì)Cd2+的最大耐受劑量.

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌的分離純化及種屬分類鑒定

1) 菌株的形態(tài)學(xué)特征及16S rRNA基因序列分析:從煤矸石自燃及風(fēng)化土壤中分離出3株細(xì)菌，細(xì)胞的形態(tài)、大小及菌落特征如圖1所示.

采用細(xì)菌通用引物測(cè)定菌株MZ1，MZ2和MF2的16S rRNA 基因序列，得到的目標(biāo)序列長(zhǎng)度分別為1 467，1 500和1 335 bp.用得到的序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blasten 檢索，結(jié)果表明菌株MZ1與Acinetobacterradioresistens，MZ2與Bacillusparamycoides及MF2與Paenarthrobactersp.序列同源性分別達(dá)到100 %，99.93 %和100%. 采用軟件MEGA4.1中的Neighbor-joining 法構(gòu)建菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示.

菌株MZ1為抗輻射不動(dòng)桿菌(A.radioresistens)，由煤矸石自燃風(fēng)化土中分離，菌株為多形球菌，細(xì)胞壁較厚且光滑，常成對(duì)出現(xiàn)，(0.8～1.2) μm × 0.6 μm；菌落圓形、米白色、不透明，邊緣光滑，革蘭氏陰性，無芽孢，無運(yùn)動(dòng)性，好氧，不能發(fā)酵，可利用糖類但不產(chǎn)酸.

Ngaiganam等[16]從法國(guó)馬賽雞和黃腿鷗中分離出3株抗輻射不動(dòng)桿菌，經(jīng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，3種分離菌株對(duì)替卡西林和厄他培南等抗菌素均具有抗藥性.Hong等[17]從廢水中分離1株抗輻射不動(dòng)桿菌(A.radioresistensCMC-1)，該菌能在堿性環(huán)境(pH 7.0～11.5)生長(zhǎng)，最適生在pH 7.5和30 ℃.該菌株可以利用三油酰甘油酯、對(duì)硝基苯酚酯、正十六烷和吐溫80為底物生產(chǎn)堿性脂肪酶ARL[17-18].另外，抗輻射不動(dòng)桿菌具有較強(qiáng)的抗旱性，能夠在31%的相對(duì)濕度(RH)下平均存活157 d[19].

菌株MZ2為擬蕈狀芽孢桿菌(B.paramycoides)，由煤矸石自燃風(fēng)化土中分離，菌株呈長(zhǎng)桿狀，(2～3.5) μm ×(1～1.5) μm；菌落呈較扁平的根狀、米白色、不透明，邊緣不整齊.革蘭氏陽性、有芽孢、無莢膜.

擬蕈狀芽孢桿菌(Bacillusparamycoides)是一種革蘭氏陽性土壤芽孢桿菌，能夠形成菌絲菌落，具有較厚的肽聚糖壁[20].Saran等[21]首次報(bào)道了擬蕈狀芽孢桿菌(B.paramycoides)ST9在含有重金屬Pb和Cd污染的土壤中，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用.在不抑制植物生長(zhǎng)的情況下，與對(duì)照組相比，菌株ST9對(duì)鉛和鎘的生物累積因子(BAF)分別增加了3倍和6倍.

菌株MF2為Paenarthrobactersp.微生物，由煤矸石風(fēng)化土中分離，菌株短桿狀，(0.5～1.8) μm× 0.3 μm；菌落呈圓形、淺黃色、不透明，邊緣光滑，革蘭氏陽性.

Paenarthrobactersp. 因細(xì)胞壁中肽聚糖組成與極性脂類型的不同，1992年由Busse等[22]將其從節(jié)桿菌屬劃分出來，模式種為Paenarthrobacteraurescens.，目前有6個(gè)種.Cao等[23]從活性污泥反應(yīng)器中分離純化出一株P(guān)aenarthrobactersp.A01細(xì)菌，該菌株對(duì)微污染物磺胺二甲嘧啶(SMZ)具有較強(qiáng)的降解作用，可將約90.7%的SMZ轉(zhuǎn)化為2-氨基-4，6-二甲基嘧啶.此外，負(fù)責(zé)磺胺類藥物分解的sad基因在A01中具有96.0%～100.0%的高度相似性.

2) 菌株的生理生化特性:3株細(xì)菌對(duì)碳源和氮源利用及酶活性特征見表2.可知1%乳酸鈉、丁酸鈉及α-酮戊二酸(微弱)是3株細(xì)菌可以共同利用的碳源，亞硝酸鉀為共同利用的氮源.

表2 3株細(xì)菌對(duì)碳源和氮源的利用能力及酶活性特征

與其他2個(gè)菌株相比，抗輻射不動(dòng)桿菌MZ1能夠利用的碳源種類不多，主要有L-乳酸、乙酸、γ-氨基丁酸、β-羥基-D,L-丁酸和丙酮酸甲酯等小分子有機(jī)酸或酯.對(duì)糖及其衍生物如D/L-巖藻糖、D-果糖-6-磷酸、D-葡萄糖醛酸、葡萄糖醛酰胺、糊精、明膠和果膠有微弱的利用能力.但具有分解利福霉素SV、林可霉素、萬古霉素、吐溫40、十四烷基硫酸鈉和四唑藍(lán)的酶.還能利用D-絲氨酸、L-精氨酸作為氮源.

擬蕈狀芽孢桿菌MZ2能耐受8%的NaCl，具有鹽酸胍、氨曲南和利福霉素SV的水解酶，對(duì)二甲胺四環(huán)素、萘啶酸和四唑紫等抗菌素有一定的分解能力.主要以多糖(糊精、果膠和明膠)、二糖(D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、蔗糖)和單糖(a-D-葡萄糖、D-果糖以N-乙酰-D-葡糖胺及D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸)作為碳源和能源，也能利用小分子有機(jī)物如甘油、1% 乳酸鈉、L-乳酸、檸檬酸、甲酸、丁酸鈉作為碳源.利用L-絲氨酸和D-絲氨酸作為氮源，此外該菌株還能利用氯化鋰、亞碲酸鉀等無機(jī)鹽作為微量元素來源.

Paenarthrobactersp.MF2利用糖類作為碳源方面與擬蕈狀芽孢桿菌MZ2相似，但可利用的糖類比MZ2更多一些(如龍膽二糖、D-棉子糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酰胺等).MF2能利用乙酸、乙酰乙酸、萘啶酸、奎寧酸等小分子有機(jī)酸作為碳源.對(duì)氨基酸的利用能力較差，只能微弱利用D-絲氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸作氮源.MF2和MZ2含有的抗生素分解酶有差異.MF2還能利用鹽酸胍、氨曲南、四唑紫和吐溫40等物質(zhì).

2.2 菌株解磷能力研究

許多學(xué)者報(bào)道了解磷細(xì)菌主要的代表是芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬、假單孢菌屬、黃桿菌屬、土壤桿菌屬、沙雷氏菌屬及微球菌屬等微生物.本研究首次發(fā)現(xiàn)Paenarthrobactersp.屬菌株也具有較強(qiáng)的解磷能力.由圖3可知，3株細(xì)菌的解磷能力由高到低依次為Paenarthrobactersp. MF2>擬蕈狀芽孢桿菌MZ2>抗輻射不動(dòng)桿菌MZ1.與對(duì)照組(CK)相比，MF2溶出磷的質(zhì)量濃度在第 72 h 達(dá)到最高，為71.76 mg·L-1，MZ2溶出磷的質(zhì)量濃度在96 h達(dá)到最高，為55.48 mg·L-1.剛接種的MZ1幾乎不具有解磷能力，培養(yǎng)至120 h，有微弱的磷溶出，其質(zhì)量濃度僅為5.79 mg·L-1.隨著時(shí)間的增加，MF2及MZ2發(fā)酵液中可溶性磷的質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì).

不同培養(yǎng)時(shí)間各組菌株解磷過程中pH的變化如圖4所示，隨著菌株的生長(zhǎng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物底物的代謝速度加快，酸性代謝產(chǎn)物(有機(jī)酸)迅速增加，發(fā)酵液中的pH逐漸降低.其中對(duì)照組(CK)的pH基本保持在7.5左右；MF2和MZ2的代謝速度較快，在24 h以內(nèi)就產(chǎn)生大量有機(jī)酸，所以發(fā)酵液中pH很快下降到6以下.

由菌株發(fā)酵過程中溶液的pH與可溶性磷的質(zhì)量濃度的Pearson相關(guān)性分析(圖5)可知，發(fā)酵液的pH與可溶性磷的質(zhì)量濃度在0.01水平上呈顯著的負(fù)相關(guān)性.說明菌株代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸有助于難溶性磷酸鹽的溶解，該結(jié)論與Rezakhani等[12]的研究結(jié)果相符.MZ1在培養(yǎng)24～72 h后，發(fā)酵液中的pH一直在7.5以上，直至100～120 h時(shí)，pH才下降到6左右，出現(xiàn)微弱的解磷現(xiàn)象.由于抗輻射不動(dòng)桿菌為好氧菌，利用碳源時(shí)不產(chǎn)生酸，所以開始時(shí)幾乎沒有解磷作用.推測(cè)在120 h時(shí)產(chǎn)生微弱的解磷能力，是由于MZ1在好氧條件下代謝產(chǎn)生的CO2與水形成的碳酸所致.抗輻射不動(dòng)桿菌細(xì)胞壁較厚且光滑，對(duì)抗菌素和干旱有較強(qiáng)的抗性[19]，同時(shí)具有耐酸的特征，能夠高效降解硫酸鹽，有較強(qiáng)的還原硫酸鹽的能力，因此可以在營(yíng)養(yǎng)貧瘠并且含硫量較高的煤矸石自燃風(fēng)化土中生存.

2.3 菌株對(duì)Cd的耐受性研究

1) 耐受細(xì)菌的篩選及最大耐受劑量:利用Cd2+的質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，50和100 mg·L-1的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，依次遞增馴化培養(yǎng)菌株，考察上述3種細(xì)菌對(duì)重金屬Cd2+的耐受性，確定它們對(duì)Cd2+的最大耐受能力.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:從煤矸石自燃風(fēng)化土中分離出的2株細(xì)菌MZ1和MZ2對(duì)重金屬Cd2+具有較大的耐受性，當(dāng)Cd2+的質(zhì)量濃度大于10 mg·L-1時(shí)，對(duì)MF2有明顯的抑制作用，但對(duì)MZ1和MZ2的生長(zhǎng)會(huì)有少許的促進(jìn)作用；當(dāng)Cd2+的質(zhì)量濃度為10～50 mg·L-1時(shí)，菌株MZ1和MZ2的生長(zhǎng)隨著Cd2+濃度逐漸增加而受到抑制；當(dāng)Cd2+的質(zhì)量濃度大于50 mg·L-1時(shí)，菌株MZ1不生長(zhǎng)；當(dāng)Cd2+的質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，菌株MZ2雖然有少量生長(zhǎng)，但延緩期延長(zhǎng).據(jù)此判斷菌株MF2，MZ1和MZ2對(duì)重金屬Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度分別為10，50和100 mg·L-1.擬蕈狀芽孢桿菌MZ2具有明顯的芽孢(圖1 b)，能耐受8%的NaCl，具有鹽酸胍、氨曲南和利福霉素 SV的水解酶，對(duì)醋竹桃霉素、二甲胺四環(huán)素、萘啶酸和四唑紫等抗菌素有一定的抗性(表2).Turchi等和Cao等均報(bào)道了擬蕈狀芽孢桿菌是抗重金屬Pb和Cd的植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑，在重金屬污染的環(huán)境下，通過誘導(dǎo)菌體細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境因子的脅迫產(chǎn)生多種生理、形態(tài)的響應(yīng)，獲得適應(yīng)性生存機(jī)制[20,23].文獻(xiàn)[24-25]的研究表明:相比于無重金屬污染的區(qū)域，重金屬污染場(chǎng)地分離出的細(xì)菌具有顯著的重金屬抗性.由表1可知， MZ和MF中重金屬Cd的質(zhì)量比均超過了撫順地區(qū)土壤背景值(0.074 mg·kg-1)，細(xì)菌長(zhǎng)期處于Cd污染的環(huán)境中，會(huì)對(duì)Cd產(chǎn)生一定的耐受性.MZ中Cd的質(zhì)量比(2.80 mg·kg-1)明顯高于MF中Cd的質(zhì)量比(1.10 mg·kg-1)，從MZ中分離出的細(xì)菌與從MF中分離的相比，菌株MZ1和MZ2對(duì)Cd均具有較高的耐受性.煤矸石風(fēng)化土及自燃風(fēng)化土中均含有較為豐富的有機(jī)質(zhì)和氮元素(見表1)，為微生物的生長(zhǎng)提供了一定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，但風(fēng)化土中有效磷含量較少[13]，菌株MZ2和MF2具有一定的解磷能力，能夠?qū)⑼寥乐械碾y溶性磷轉(zhuǎn)化為有效磷，并通過自身的代謝活動(dòng)改良土質(zhì)，增強(qiáng)土壤肥力，為植物生長(zhǎng)提供可能.

3 結(jié) 論

1)Paenarthrobactersp. 屬菌株MF2具有較高的解磷能力，對(duì)磷酸鈣的溶解能力在72 h可達(dá)71.76 mg·L-1，但是該菌株對(duì)重金屬Cd2+的耐受性最差，僅為10 mg·L-1；抗輻射不動(dòng)桿菌MZ1對(duì)Cd2+有較高的耐受性(50 mg·L-1)，但解磷能力最弱(120 h，5.79 mg·L-1)；擬蕈狀芽孢桿菌MZ2有較強(qiáng)的解磷能力(96 h，55.48 mg·L-1)，對(duì)Cd2+有很大的耐受性(100 mg·L-1)，具有開發(fā)成為重金屬抗性微生物磷肥的潛力.在污染土壤環(huán)境中，后續(xù)將深入研究重金屬脅迫下的細(xì)菌解磷作用機(jī)理，以期用于解決利用植物修復(fù)重金屬Cd污染土壤時(shí)所面臨的磷素缺乏問題.

2) 菌株MF2和MZ2的解磷機(jī)理主要是通過代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)不溶性磷酸鹽的溶解作用，可將產(chǎn)酸菌作為土壤的生物修復(fù)劑，耐受重金屬的產(chǎn)酸菌用于強(qiáng)化重金屬污染場(chǎng)地的生態(tài)修復(fù)，不耐受重金屬的產(chǎn)酸菌用于強(qiáng)化未受重金屬污染但磷缺乏土地的生態(tài)修復(fù).