二次重度離心制備法對冷沉淀凝血因子質(zhì)量的影響*

余鳳秀 李津杞 朱燕霞 郭菲 周載鑫 顧?；?錢寶華

冷沉淀凝血因子是采用特定的方法將保存期內(nèi)的新鮮冰凍血漿（FFP）在1～6℃封閉狀態(tài)融化后，分離出大部分血漿，剩余的冷不溶解物質(zhì)在1 h內(nèi)凍結(jié)而制成的成分血[1]。其主要成分包括凝血因子Ⅷ（FⅧ）、纖維蛋白原（FIB）、血管性血友病因子（vWF）、凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）以及纖維連接蛋白（Fn）[2]。輸注冷沉淀凝血因子是臨床預(yù)防和治療出凝血功能異常的有效方法之一，適用于纖維蛋白原缺乏癥、甲型血友病、血管性假性血友病、大手術(shù)及大出血患者等。依據(jù)2012版《全血及成分血質(zhì)量要求》，冷沉淀中FⅧ含量≥40 IU/200 mL全血新鮮冰凍血漿制備，F(xiàn)IB含量≥75 mg/200 mL全血新鮮冰凍血漿制備[1]。FⅧ是一種不穩(wěn)定的凝血因子，確保FⅧ活性，本研究實(shí)驗(yàn)探討新鮮冰凍血漿中殘留紅細(xì)胞含量對冷沉淀凝血因子中FⅧ的影響。通過比較一次和二次重度離心新鮮冰凍血漿方法制備的冷沉淀凝血因子中殘留血紅蛋白含量，觀察到游離血紅蛋白含量可直接影響冷沉淀凝血因子FⅧ含量，從而影響冷沉淀凝血因子的質(zhì)量?，F(xiàn)將兩種方法制備的冷沉淀凝血因子質(zhì)量的比較報告如下。

材料與方法

1 儀器與試劑

1.1 儀器：大容量離心機(jī)（美國Scientific）；低溫KJX-Ⅲ型冰凍血漿解凍箱（蘇州）；CA-550全自動血凝儀（日本希斯美康）; 756MC紫外分光光量儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑 泛Ⅷ因子活性測定試劑盒（批號：548582）；緩沖液（批號：548006）；CaCl2（批號：538970）；纖維蛋白原測定試劑盒（批號：537257）。以上試劑均由日本希斯美康公司提供，且均在有效期內(nèi)使用。

2 方法

2.1 制備新鮮冰凍血漿：一共采集40袋全血（采集時間＜7 min），每袋200 mL，采集過程按《血站技術(shù)操作規(guī)程》2019版[3]執(zhí)行，6 h內(nèi)于4℃一次重度離心（4 834 g）15 min，手工分離取上層135 mL新鮮冰凍血漿。隨機(jī)分實(shí)驗(yàn)組、對照組，每組20袋。實(shí)驗(yàn)組于4 ℃再次重度離心（2 626 g）10 min，手工分離上層血漿，用于制備新鮮冰凍血漿。實(shí)驗(yàn)組、對照組新鮮冰凍血漿同時放入–80℃深低溫冰箱速凍，并在–80℃條件下儲存14天后用以制備冷沉淀凝血因子。

2.2 制備冷沉淀凝血因子：14天后，將實(shí)驗(yàn)組、對照組新鮮冰凍血漿同時取出，置（4±2）℃冰箱中過夜融化，以2 800 g，4℃，離心10 min。分出上層血漿100 mL（±10 mL），剩余25～30 mL血漿與白色沉淀物混合，立即置于–50℃速凍，制備冷沉淀凝血因子，1 h后移至–20℃冰箱保存。

2.3 凝血因子的質(zhì)量控制：將實(shí)驗(yàn)組、對照組同時置37 ℃水浴箱中融化，時間不超過10 min，完全溶解后取樣，30分鐘內(nèi)完成檢測。

2.4 游離血紅蛋白的檢測：紫外可分光光度儀（型號：N4S）檢測游離血紅蛋白的含量：用血紅蛋白分子中亞鐵血紅素具有類過氧化酶活物，催化H2O2釋放活性氧，使酚以及4-AAP氧化生成紅色物體，顏色深淺與Hb含量成正比。所有操作嚴(yán)格遵守儀器、試劑說明書。

2.5 FⅧ和FIB含量測定：CA-550全自動血凝儀（日本希斯美康）檢測FⅧ和FIB含量，所有操作均嚴(yán)格遵守儀器、試劑說明書執(zhí)行。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩種方法制備的冷沉淀中游離血紅蛋白含量對比實(shí)驗(yàn)組游離血紅蛋白含量明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2 兩種方法制備的冷沉淀凝血因子中FⅧ和FIB含量對比 實(shí)驗(yàn)組FⅧ含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。FIB含量無顯著性差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩種方法制備的冷沉淀凝血因子中游離血紅蛋白和凝血因子含量比較

3 冷沉淀凝血因子制品合格率對比 FIB含量均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)；FⅧ含量合格率對照組低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,參照《全血及成分血質(zhì)量要求》，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：每100 mL新鮮冰凍血漿制備冷沉淀凝血因子FⅧ≥40 IU/單位、FIB≥75 mg/單位為合格，見表2。

表2 兩種方法制備冷沉淀凝血因子的合格率比較

討 論

冷沉淀凝血因子主要成分為FⅧ、FIB、Fn、vWF，具有止血、促進(jìn)組織修復(fù)的作用。在臨床實(shí)踐中，冷沉淀凝血因子主要用于治療FⅧ因子缺乏所導(dǎo)致的凝血功能障礙，如甲型血友病等。同時在主動脈夾層等出血較多的手術(shù)中以及急性大量失血時，可以起到良好的止血功能[4]?！度俺煞盅|(zhì)量要求》（GBl8469-2012）對冷沉淀凝血因子FⅧ與FIB含量有明確要求：來源于200 mL全血的冷沉淀凝血因子中FⅧ含量（IU）≥40 IU，F(xiàn)IB含量≥75 mg[1]。因此，F(xiàn)Ⅷ和FIB實(shí)際含量既是冷沉淀凝血因子的關(guān)鍵質(zhì)量控制指標(biāo)也是實(shí)際療效的保證。為提高臨床輸注療效，制備過程中應(yīng)最大限度地保留FⅧ和FIB?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程》2019版要求制備過程中，盡量去除紅細(xì)胞[3]，研究表明，在新鮮冰凍血漿冷凍時可使殘留的紅細(xì)胞破裂，從而激活促凝血系統(tǒng)，影響Ⅷ因子的穩(wěn)定性[5，6]，因此冷沉淀原料血漿袋內(nèi)應(yīng)盡量減少殘留紅細(xì)胞成分。本研究中發(fā)現(xiàn)，游離血紅蛋白含量與冷沉淀中FⅧ含量成負(fù)相關(guān)。

冷沉淀凝血因子制備方法包括離心法和虹吸法，研究表明，虹吸法通過晃動水浴箱達(dá)到加速融化的目的，容易將析出的沉淀物質(zhì)晃散，造成成品效價低[7]。離心法將解凍的新鮮冰凍血漿經(jīng)4 ℃條件下重度離心后，不溶物質(zhì)沉淀在血袋底部，提高回收率。但實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)一次重離新鮮冰凍血漿（冷沉淀凝血因子原料漿）制備的冷沉淀凝血因子上清液易呈現(xiàn)淡紅色，經(jīng)檢測游離血紅蛋白含量增加，F(xiàn)Ⅷ含量低于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品合格率降低。因此本實(shí)驗(yàn)在制備新鮮冰凍血漿的一次離心法的基礎(chǔ)上，通過增加一次重度離心，減少紅細(xì)胞殘留，從而減少冷沉淀凝血因子游離血紅蛋白含量，以提高冷沉淀凝血因子的質(zhì)量。經(jīng)檢測，實(shí)驗(yàn)組冷沉淀凝血因子中的游離血紅蛋白含量低于對照組，F(xiàn)Ⅷ含量和合格率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而FIB含量兩組均達(dá)到國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，合格率均為100%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05)。結(jié)果表明冷沉淀凝血因子中游離血紅蛋白含量與FⅧ含量呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)IB含量不受影響。目前，二次離心新鮮冰凍血漿(冷沉淀凝血因子原料漿)制備的冷沉淀凝血因子，增加一次2 626 g，4℃，10 min，離心制備新鮮冰凍血漿(冷沉淀凝血因子原料漿)，最大程度去除殘留紅細(xì)胞，降低新鮮冰凍血漿（冷沉淀凝血因子原料漿）血紅蛋白含量，對提高冷沉淀凝血因子中FⅧ含量具有積極的指導(dǎo)意義。

冷沉淀凝血因子中的FⅧ活性極不穩(wěn)定，半衰期只有8～12 h，而且受獻(xiàn)血者自身凝血因子質(zhì)量、血液采集、制備及運(yùn)輸?shù)戎T多因素影響。如選擇專業(yè)的全自動冷沉淀凝血因子制備設(shè)備和縮短速凍時間可明顯提高FⅧ活性[8-11]。據(jù)報道，全血采集后22 ℃、6 h內(nèi)離心制備新鮮冰凍血漿，F(xiàn)Ⅷ活性幾乎無差異，但隨著時間延長，超過24 h制備的新鮮冰凍血漿，F(xiàn)Ⅷ活性下降30%[12]。本實(shí)驗(yàn)均在全血采集后6 h內(nèi)，離心制備新鮮冰凍血漿，兩組冷沉淀凝血因子外觀均為黃色澄清液體，無色澤異常、蛋白析出、氣泡及重度乳糜等情況。此外，兩組合格率均符合《血站技術(shù)操作規(guī)程》質(zhì)量控制要求的75%合格率。說明二次重度離心法不僅符合臨床輸注的冷沉淀凝血因子標(biāo)準(zhǔn)要求，同時可提高冷沉淀凝血因子的質(zhì)量。因此，采用二次重度離心新鮮冰凍血漿（冷沉淀原料漿）制備冷沉淀凝血因子是可行的。

綜上所述，根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》一次重度離心，目測殘留紅細(xì)胞較少即可制備成新鮮冰凍血漿[3]。而本文中通過二次重度離心，可以最大程度去除新鮮冰凍血漿中殘留的紅細(xì)胞，可提高單位體積內(nèi)FⅧ的含量，減少患者冷沉淀凝血因子輸注總量，降低輸血反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險，提高臨床輸血療效。二次重度離心法對冷沉淀凝血因子質(zhì)量更有保障，對血液成分制備工作有重要指導(dǎo)意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突