大黃素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療作用及抗炎機(jī)制研究

田新瑋 鄭琦麗 王 靜 蘇敏慧 周文濤 陳 昶

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊830011；2.滕州市中醫(yī)醫(yī)院，山東滕州277500）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其主要表現(xiàn)為滑膜炎癥，同時會引起關(guān)節(jié)細(xì)胞壞死等[1]。RA可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，主要由于風(fēng)、寒、濕邪侵襲，導(dǎo)致氣血凝滯，經(jīng)絡(luò)痹阻而引起肢體關(guān)節(jié)病變[2-3]。目前治療RA的藥物主要包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素以及植物藥[4]。大黃素是中藥虎杖的生物活性組分，具有抗腫瘤、抗微生物生長、解痙、止咳和利尿等作用，對RA具有治療作用[5-6]。彭菲菲等[7]研究表明，大黃素對體外培養(yǎng)的RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。本研究旨在觀察大黃素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療作用，并探索其治療機(jī)理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級3周齡SD大鼠60只，購自廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，粵監(jiān)證字2004A029號。所有大鼠均在新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%。本實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)同意，審批編號：20180302145。

1.2 藥物與試劑 大黃素（貨號：E8390；純度＞98%）購自北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒購自美國Sigma公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）及Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）抗體購自北京傲銳東源生物科技有限公司；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3，貨號sc-7272）、高遷移族轉(zhuǎn)移蛋白1（HMGB1，貨號sc-74085）購自美國Santa Cruz公司；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司。

1.3 主要儀器 BS-124s型電子天平，北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；3-5W低溫離心機(jī)，湖南恒諾離心機(jī)有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機(jī)，長沙益廣制藥機(jī)械公司。

2 實驗方法

2.1 分組、造模與給藥 將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、大黃素低劑量組和大黃素高劑量組，每組15只。除空白對照組外，其余各組大鼠采用不完全氟氏佐劑及牛Ⅱ膠原乳化劑制成類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，制作方法及判斷造模是否成功參考黃順等[8]的研究。具體操作如下：將乙酸溶液中溶解牛Ⅱ型膠原制成2 g/L的膠原溶液，取400 μg膠原乳化劑注射于大鼠右足跖部皮下以致炎，并于造模第14日用100 μg膠原乳化劑同法注射以加強(qiáng)。炎癥表現(xiàn)程度大約在造模20 d左右達(dá)到高峰。20 d時通過大鼠足跖相機(jī)拍照和X線攝片觀察，出現(xiàn)嚴(yán)重紅腫、連續(xù)低密度影及溶骨現(xiàn)象表明造模成功。本研究所有造模大鼠均造模成功。造模第21日開始，大黃素低劑量組和高劑量組分別予40 mg/kg和80 mg/kg大黃素灌胃，空白對照組和模型組灌胃等量生理鹽水，每日灌胃1次，持續(xù)14 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 大鼠足腫脹度檢測并計算腫脹率 用水容積法檢測各組大鼠足腫脹度。從造模開始后每周末檢測1次共檢測5次，同一只大鼠每次檢測同一只足。以第1次測得的關(guān)節(jié)置換水容積為基值，以后每測得的值與之相比得出的比值為關(guān)節(jié)腫脹率。

2.2.2 血清炎癥因子檢測 末次給藥并完成足腫脹度檢測后，各組大鼠麻醉，腹主動脈取血分離血清0.5 mL，在低溫離心機(jī)中以離心半徑8 cm，3000 r/min離心15 min，取上清液嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

2.2.3 大鼠滑膜病理學(xué)評分 取血后處死大鼠，取右足踝關(guān)節(jié)，剪開皮膚，用顯微外科手術(shù)剪刀和鑷子在髖關(guān)節(jié)的周圍剪下滑膜組織（為白色海綿狀），清理，修剪，固定于4%多聚甲醛中，關(guān)節(jié)組織直接凍存。觀察各組大鼠滑膜細(xì)胞增生、滑膜下層炎癥程度及血管生成情況，對大鼠滑膜病理學(xué)進(jìn)行評分?；ぜ?xì)胞增生評分：0分，少于3層；1分，3～4層；2分，5～6層；3分，6層以上。炎癥程度評分：0分，無淋巴細(xì)胞浸潤；1分，淋巴細(xì)胞聚集；2分，出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤且形成淋巴濾泡；3分，出現(xiàn)較多炎性細(xì)胞且以濾泡增生為主伴生發(fā)中心進(jìn)行性轉(zhuǎn)化。血管生成評分：0分，無新生血管生成；1分，輕度新生血管生成；2分，中度新生血管生成；3分，重度新生血管生成。以上3項評分總和即為滑膜病理學(xué)總評分。

2.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測大鼠關(guān)節(jié)組織蛋白表達(dá) 使用Western Blot檢測HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白。取凍存的大鼠關(guān)節(jié)組織，剪刀剪碎，胰蛋白酶消化，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，作圖采用GraphPad Prism 5軟件，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠足腫脹率比較 實驗第1、2周末，各組大鼠足腫脹率比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；實驗第3、4、5周末，模型組和大黃素低、高劑量組大鼠足腫脹率顯著高于空白對照組（P＜0.01）；實驗第4、5周末大黃素低、高劑量組大鼠足腫脹率顯著低于模型組（P＜0.01），且高劑量組明顯低于低劑量組（P＜0.01）。見表1。

3.2 各大鼠血清炎癥因子比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠上述指標(biāo)顯著降低（P＜0.01），高劑量組明顯低于低劑量組（P＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠實驗各時期足腫脹率比較（±s）

表1 各組大鼠實驗各時期足腫脹率比較（±s）

注： 與同時期空白對照組比較，**P＜0.01；與同時期模型組比較，##P＜0.01；與同時期大黃素低劑量組比較，△△P＜0.01。

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表2 各組大鼠血清炎癥因子比較（±s） 單位：pg/mL

表2 各組大鼠血清炎癥因子比較（±s） 單位：pg/mL

注： 與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與大黃素低劑量組比較，△△P＜0.01。

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3.3 各組大鼠滑膜病理學(xué)評分比較 見表3。

3.4 各組大鼠關(guān)節(jié)組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較 見圖1、表4。

表3 各組大鼠滑膜病理學(xué)評分比較（±s） 單位：分

表3 各組大鼠滑膜病理學(xué)評分比較（±s） 單位：分

注： 與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與大黃素低劑量組比較，△△P＜0.01。

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圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)組織HMGB1、Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

注： 與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與大黃素低劑量組比較，△△P＜0.01。

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4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，抗體即類風(fēng)濕因子會與自身抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，這些免疫復(fù)合物會導(dǎo)致滑膜增厚、充血、水腫[9]。檢測大鼠足腫脹度可以在一定程度上反映其類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模前各組大鼠足腫脹率無顯著性差異，造模后模型組與給藥組大鼠足腫脹率顯著高于空白對照組，使用大黃素治療后，各治療組大鼠足腫脹率顯著低于模型組。說明大黃素可以有效改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀。

細(xì)胞因子主要可分為促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子兩種[11]。IL-1β、IL-6、TNF-α是兩種重要的促炎性細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞等分泌，是炎癥的重要介導(dǎo)物質(zhì)[12-14]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高，使用大黃素干預(yù)后，大鼠血清上述炎癥因子含量顯著降低。說明大黃素可以有效降低大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，這可能因為大黃素可以抑制NF/KB信號通路，抑制其下游的炎癥因子表達(dá)從而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

關(guān)節(jié)細(xì)胞凋亡會加重類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病情，目前關(guān)于凋亡相關(guān)基因研究較多，較為常見的是Bcl-2家族和Caspase家族蛋白，其中Bcl-2家族中Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達(dá)量決定細(xì)胞是否凋亡[15-16]。Bax和Bcl-2表達(dá)呈相反趨勢，當(dāng)Bcl-2表達(dá)下降時，Bax表達(dá)上升，此時會促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；當(dāng)Bcl-2表達(dá)升高，而Bax表達(dá)降低，則抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織中HMGB1及Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，使用大黃素處理后關(guān)節(jié)組織中HMGB1及Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高。說明大黃素可以有效降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織細(xì)胞的凋亡。

綜上，大黃素可以通過降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)同時抑制關(guān)節(jié)組織細(xì)胞的凋亡，以緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀。在后續(xù)的實驗中將進(jìn)一步增加大黃素的濃度梯度，并探討不同濃度大黃素通過相關(guān)信號通路對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)影響的作用機(jī)制。