重組酶聚合酶擴(kuò)增法在嬰幼兒食品克羅諾桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用

郝娟，吳婕，佘之蘊(yùn)，張娟

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510610；2.廣州力衡臨床營(yíng)養(yǎng)品有限公司，廣州510610；3.廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東佛山528300）

0 引 言

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）是一類革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，一種重要的條件致病菌?？肆_諾桿菌屬于2008年由Iversen等建立[1-3]，之前被稱作阪崎腸桿菌（Enterbacter sakazakii）。Strydom等于2012年根據(jù)DNA雜交、表型分型、16SrRNA測(cè)序和多序列分析法對(duì)該屬菌株進(jìn)行重新分類，確定其包括7個(gè)種和3個(gè)亞種[4]。該菌感染新生兒可引起腦膜炎、菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病[5]，并可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥和較高的死亡率。嬰幼兒配方乳粉是感染克羅諾桿菌的主要渠道。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中均明確規(guī)定0～6月齡嬰幼兒配方食品不得檢出克羅諾桿菌，而嬰幼兒輔助食品中克羅諾桿菌的限量在國(guó)內(nèi)外均未做出相應(yīng)規(guī)定。基于此，針對(duì)免疫力低下的群體，該菌的污染存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，克羅諾桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，但因?yàn)闄z測(cè)周期長(zhǎng)，無(wú)法及時(shí)應(yīng)對(duì)突發(fā)事件。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，各種快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率[6-7]。但這些技術(shù)存在需要使用復(fù)雜的儀器，對(duì)操作人員要求高等問(wèn)題，限制了其在應(yīng)急檢測(cè)中的應(yīng)用。核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于無(wú)需特殊設(shè)備，反應(yīng)速度快，靈敏度高等特點(diǎn)，在諸多領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）作為一種新型的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)模式與PCR類似，但不需要加熱變性步驟，而是利用重組酶代替高溫解鏈，采用單鏈結(jié)合蛋白防止DNA復(fù)性，整個(gè)反應(yīng)僅需15～20 min完成。相對(duì)比較成熟的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，RPA引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，無(wú)需加熱反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物可進(jìn)行后續(xù)分析。本研究以重組酶聚合酶擴(kuò)增法為主要檢測(cè)技術(shù)，對(duì)比國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法和熒光定量檢測(cè)方法的結(jié)果，調(diào)查嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的污染狀況。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品采購(gòu)自大型商場(chǎng)、超市、母嬰店、藥店及網(wǎng)購(gòu)的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口嬰幼兒配方乳粉以及嬰幼兒谷物食品，共196個(gè)品牌560份樣品，樣品包裝完整且均在保質(zhì)期內(nèi)。

1.2 材料與設(shè)備

培養(yǎng)基：BPW 培養(yǎng)基、改良月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯—萬(wàn)古霉素(mLST-Vm)肉湯、胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基(DFI)。

試劑：Premix Taq DNA聚合酶；食品基因組提取試劑盒；細(xì)菌基因組提取試劑盒；RAA熒光檢測(cè)試劑盒；所用引物和探針由上海生工生物公司合成。

設(shè)備：CL-40M高壓滅菌鍋；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱；AC2-6S1生物安全柜；玻璃熱珠滅菌器；Easy-mix拍擊式均質(zhì)器；dilumat S電子稀釋器；Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)；QuantStudio 7 Flex熒光PCR儀；DK-8D電熱恒溫水槽；3-30K高速冷凍離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)克羅諾桿菌

按照GB 4789.40-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》的檢測(cè)流程進(jìn)行檢驗(yàn)。無(wú)菌條件下取檢樣100 g加入900 mL已預(yù)熱至44℃的緩沖蛋白胨水中，充分溶解后于36±1℃培養(yǎng)18±2 h。移取1m L轉(zhuǎn)種于10 mL（mLST-Vm）肉湯，44±0.5℃培養(yǎng)24±2 h。各取增菌液1環(huán)，分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36±1℃培養(yǎng)24±2h。挑取可疑菌落劃線接種于TSA平板，25±1℃培養(yǎng)48±4 h。自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，用VITEK2全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)克羅諾桿菌

參照SN/T 1632.3-2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗(yàn)方法第3部分：熒光PCR方法》的檢測(cè)方法進(jìn)行。取2.1中的增菌液用于細(xì)菌基因組的提取，操作按照細(xì)菌基因組提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。熒光PCR檢測(cè)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求操作，根據(jù)檢測(cè)樣品Ct值報(bào)告陽(yáng)性或陰性結(jié)果。

1.3.3 RPA法檢測(cè)克羅諾桿菌

按照RRA熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)體系為50μL，向裝有干粉酶制劑的反應(yīng)管中加入45.5μL反應(yīng)緩沖液，再分別加入2.0μL待測(cè)DNA、陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照，在反應(yīng)管蓋上加入2.5μL的醋酸鎂溶液，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10 s。RAA反應(yīng)干粉酶制劑包含SSB單鏈結(jié)合蛋白、重組酶蛋白、DNA聚合酶、Exo核酸外切酶和輔酶等。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：預(yù)熱，39℃，40 s，一個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增，39℃，30 s，30個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的污染狀況

本次檢測(cè)嬰幼兒食品主要包括嬰幼兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品以及嬰幼兒谷類輔助食品三大類。由表1可看出，克羅諾桿菌的總體檢出率為2.68%，其中嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品的檢出率為0，嬰幼兒谷類輔助食品檢出率為4.84%。本次嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢出情況相比之前的國(guó)內(nèi)報(bào)道，均表現(xiàn)在嬰幼兒谷類輔助食品的檢出率普遍較高，而嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品則相對(duì)穩(wěn)定，檢出率低，總體污染情況處于相對(duì)較低的水平[8-10]。

表1 不同種類嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢出情況

2.2 不同檢測(cè)方法在嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的檢測(cè)情況

本次檢測(cè)主要運(yùn)用RPA方法，輔以傳統(tǒng)培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR法加以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。對(duì)560份樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3種檢測(cè)方法的定性結(jié)果一致。如表2所示，在檢測(cè)結(jié)果一致的前提下，對(duì)比3種檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)，RPA方法大大提高了檢測(cè)效率，雖然鑒于檢測(cè)原理是核酸擴(kuò)增，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果，但對(duì)于樣品初篩可以提供很大的便利性。

表2 3種檢測(cè)方法的比較

3 結(jié) 論

本研究確定了RPA方法檢測(cè)嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的可行性及準(zhǔn)確性，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和實(shí)時(shí)熒光PCR法獲得一致的結(jié)果。與上述兩種方法相比較，RPA法體現(xiàn)出了在檢測(cè)效率方面的優(yōu)越性，適于樣品初篩和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，有利于及時(shí)應(yīng)對(duì)食品突發(fā)事件。

基于本次檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品克羅諾桿菌未檢出，而嬰幼兒谷類輔助食品則檢出率較高。有研究顯示，淀粉成分相比其他配方成分更容易引起克羅諾桿菌的污染[11]，因此，以淀粉原料為主的谷類輔食更容易受到該菌的污染。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)較大嬰兒和幼兒配方食品和嬰幼兒谷類輔助食品中克羅諾桿菌未規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合該類產(chǎn)品的食用方法及污染情況，對(duì)嬰幼兒的健康會(huì)產(chǎn)生潛在的危害。國(guó)外曾有報(bào)道由于該類產(chǎn)品污染克羅諾桿菌引起較大嬰兒發(fā)病的案例[8]，基于此，食品安全監(jiān)管部門應(yīng)考慮將該類產(chǎn)品納入風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的范圍，保障特殊人群的食用安全。